王秋華 陳麗竹 劉曉麗 黃鈞 羅世強(qiáng) 張玲 謝莉 暢榮妮 唐寧( 通訊作者)

( 柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科 廣西 柳州 545001)

葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，G6PD）缺乏癥是世界上最常見的單基因病之一，也是一種X 性染色體不完全顯性遺傳性溶血性紅細(xì)胞酶缺陷病。我國的發(fā)病率為4.4%～16.6%，而廣西的發(fā)病率則達(dá)到10.75%[1]。G6PD缺乏癥的實(shí)質(zhì)是G6PD基因發(fā)生突變，患者在臨床上有多種表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致新生兒期核黃疸引起永久性神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或死亡。

目前G6PD 酶活性的檢測是最常用的篩查方法，由于女性雜合子的酶活性具有較大的異質(zhì)性，該方法容易發(fā)生漏診[2-3]，故建立有效的基因檢測方法對(duì)于明確診斷疾病，臨床合理用藥，處理新生兒黃疸及完善人類遺傳學(xué)資料來說具有重大意義。

1.資料和方法

1.1 一般資料

選取2016 年6 月—2020 年2 月在我院進(jìn)行G6PD 基因型及G6PD 酶活性檢測的260 例女性樣本。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 采用廈門致善生物科技有限公司Lab-Aid 820 全自動(dòng)核酸提取儀及配套的磁珠法核酸提取試劑盒對(duì)血濾紙片樣本進(jìn)行核酸提取。

1.2.2 G6PD 基因型檢測 采用廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒，檢測中國人中常見的12 個(gè)位點(diǎn)的基因突變及對(duì)應(yīng)的野生型，結(jié)果參照試劑盒說明書進(jìn)行樣本基因型判讀。

2.結(jié)果

203 例酶活性異常的女性樣本中檢測出180 例基因突變（88.67%），其中復(fù)合雜合突變75 例，純合突變23 例，雜合突變82 例；57 例酶活性正常的女性樣本中檢測出48 例基因突變（84.21%），其中復(fù)合雜合突變2 例，雜合突變46 例，雜合突變占突變類型的95.83%。在260 例樣本中檢測出最常見的突變依次為95A ＞G（19.30%），1388G ＞A（18.86%），1376G＞T（20.61%），具體分布情況見表1。

3.討論

G6PD 酶活性降低是由于G6PD 基因發(fā)生變異導(dǎo)致G6PD 酶結(jié)構(gòu)改變引起的，目前發(fā)現(xiàn)的G6PD 基因變異絕大多數(shù)為點(diǎn)突變，即1 個(gè)或2 個(gè)堿基替換，極少數(shù)為基因片段缺失，暫未發(fā)現(xiàn)諸如啟動(dòng)子突變、框架突變及多聚A 位點(diǎn)突變等突變類型。迄今全世界已報(bào)道180 多種G6PD 基因突變類型，在我國已發(fā)現(xiàn)35種點(diǎn)突變[4]，在260 例樣本中檢測出最常見的突變?yōu)?5A ＞G（19.30%），1388G ＞A（18.86%），1376G ＞T（20.61%），與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。酶活性異常的女性樣本中G6PD 基因突變檢出率為88.67%，仍有23 例未檢測出突變，有可能是屬于12種以外的突變類型，需要進(jìn)一步測序驗(yàn)證。

G6PD/6PGD 比值法、高鐵血紅蛋白還原試驗(yàn)、硝基四氮哇藍(lán)法（NBT）、熒光斑點(diǎn)法等是臨床上最基本、最常用的篩查G6PD 酶活性的方法，這些方法均不能有效準(zhǔn)確檢出紅細(xì)胞G6PD缺乏的雜合子。而在57 例G6PD 酶活性正常的女性患者中檢測出48 例基因突變，漏診率（48/57，84.21%），這提示應(yīng)用傳統(tǒng)的酶活性檢測方法可能漏檢女性雜合子，導(dǎo)致漏診率高可能有以下幾種原因：

1）常用的篩查方法是基于G6PD 酶活性的測定方法，該方法的參考值只是用（±s）表示。對(duì)于酶活性缺乏程度未劃分出明確的界限值，而女性雜合子的酶活性可以呈多樣性表現(xiàn)。由于表型與基因型不完全一致，使得女性雜合子個(gè)體的準(zhǔn)確診斷相當(dāng)困難。現(xiàn)在很多研究者進(jìn)行大規(guī)模新生兒G6PD 酶活性篩查切值的探討，尤其是女性雜合子切值確定[6-9]，若能通過基因檢測與酶活性檢測的對(duì)比獲得女性雜合子的酶活性切值，可通過酶活性檢測提高女性雜合子的檢出率。2）根據(jù)Lyon 假說，女性的兩個(gè)G6PD 等位基因，有一個(gè)處于隨機(jī)失活狀態(tài)，女性雜合子實(shí)際上含有酶活性正常和缺乏的兩類紅細(xì)胞，兩者的比例決定酶活性的檢測結(jié)果。若女性雜合子中酶活性正常的紅細(xì)胞比例大于缺乏的紅細(xì)胞，其酶活性可接近正常；反之則顯著缺乏，所以酶活性的檢測方法容易出現(xiàn)漏診。3）G6PD 缺乏癥患兒在急性溶血期新生幼稚紅細(xì)胞增多，新生紅細(xì)胞酶活性較高，因此在急性溶血期G6PD 重度缺乏者可能酶學(xué)檢測結(jié)果僅輕度缺乏，女性雜合子酶活性可正常。4)G6PD 基因突變類型因素，G6PD 基因突變具有高度的遺傳異質(zhì)性。有研究表明女性雜合子的G6PD 酶活性含量可能與G6PD 基因甲基化的水平有關(guān)[10]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，基因突變類型影響G6PD 酶的功能結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致不同水平的酶缺乏癥和疾病表現(xiàn)[11]。

表1 260 例女性樣本檢測出基因突變的分布情況[n(%)]

國內(nèi)外已廣泛證實(shí)G6PD 缺乏雜合子可發(fā)病，且G6PD 缺乏癥雜合子是新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，女性雜合子也極有可能發(fā)展為有癥狀的G6PD 缺陷，漏檢G6PD 缺乏癥雜合子可能對(duì)新生兒高膽紅素血癥的診斷治療，人體生命健康等方面有極大影響。G6PD 缺乏雜合子的表型變化大，但其基因突變類型相對(duì)確定，不受表型變化和酶活性干擾，嚴(yán)提珍等[12]運(yùn)用多色探針熒光PCR 熔解曲線法對(duì)G6PD 基因突變檢測，這種方法簡易操作，準(zhǔn)確度高，快速靈敏。本結(jié)果提示利用多色探針熒光PCR 熔解曲線的基因突變檢測方法可以有效的檢出女性雜合子，而傳統(tǒng)的酶學(xué)檢測極易漏檢G6PD 酶活性正常的女性雜合子。為避免漏診或誤診，應(yīng)重視基因檢測對(duì)G6PD 酶活性正常女性的臨床診斷價(jià)值，將其廣泛應(yīng)用到臨床診斷中，與G6PD 酶活性檢測相結(jié)合，共同指導(dǎo)未來的遺傳咨詢及精準(zhǔn)診斷工作。