王筠竹, 楊彩霞, 于美春, 侯秋實(shí)

(沈陽大學(xué) 遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 沈陽 110044)

花生(ArachishypogaeaLinn.)屬豆科落花生屬的一年生草本植物,果實(shí)富含油脂及蛋白質(zhì),不僅是食用廣泛、營養(yǎng)豐富的優(yōu)質(zhì)堅(jiān)果,還是食用油、花生蛋白等產(chǎn)品的主要原料之一[1].花生在全世界廣泛種植,但隨著經(jīng)濟(jì)全球化帶來的衍生影響,植物病毒的傳播速度及其蔓延范圍均呈現(xiàn)快速的上漲趨勢[2].截至目前,國內(nèi)外已發(fā)布的報(bào)道表明,花生可被28種病毒(分布在7個科12個屬內(nèi))自然侵染[3].在中國,侵染花生的病毒有花生條紋病毒(Peanutstripevirus, PStV)、花生矮化病毒(Peanutstuntvirus, PSV)、花生斑駁病毒(Peanutmottlevirus, PeMoV)、番茄斑萎病毒(Tomatospottedwiltvirus, TSWV)、黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus, CMV)、辣椒褪綠病毒(Capsicumchlorosisvirus, CaCV)和花生褪綠扇斑病毒(Peanutchoroticfan-spotvirus, PCFSV)[4].其中,PStV已被證實(shí)與菜豆普通花葉病毒(Beancommonmosaicvirus, BCMV)有密切的血清學(xué)關(guān)系,被作為BCMV的亞群成員[5-8],本文統(tǒng)一將文獻(xiàn)報(bào)道中的PStV寫成BCMV-PStV.

BCMV是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的成員,基因組為一條長度約10 000 nt的正義單鏈RNA,編碼一個多聚蛋白(Polyprotein)隨后被切割成11個成熟蛋白[9-10],在5′端具有病毒末端結(jié)合蛋白(genome-linked protein, VPg),3′端具有多聚合腺苷酸(Poly A)尾巴.BCMV的傳播是非持久性的,在自然條件下主要通過蚜蟲傳播并侵染多種菜豆屬植物,對我國廣泛種植的豆科植物如大豆、菜豆、豇豆等的規(guī)?；a(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅[8,11-14].近年來,受BCMV侵染引發(fā)的植物病毒病害已經(jīng)在中國浙江、山東和南京等多地的經(jīng)濟(jì)作物上廣泛、頻繁發(fā)生,如豇豆、扁豆、花生和芝麻等[15-21],造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失.在遼寧,僅有韓彤等[22]從菜豆上分離鑒定BCMV的正式報(bào)道.此外,在GenBank數(shù)據(jù)庫可查到一個BCMV遼寧花生分離物的全長信息(BCMV-[CN∶LN∶Peanut],MH628437).2017年9月,在遼寧沈陽發(fā)現(xiàn)疑似感染病毒的花生樣品,經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增病毒的全基因組序列,確定了侵染花生的病毒為BCMV.

1 材料與方法

1.1 材 料

2017年9月,于遼寧省沈陽市開展植物病害調(diào)查研究過程中,發(fā)現(xiàn)了花生葉片褪綠斑駁病害.選擇并采集具有典型褪綠斑駁癥狀的花生葉片(圖1)置于-80 ℃的超低溫冰箱內(nèi)保存.

圖1 花生感染BCMV后葉片褪綠斑駁癥狀

1.2 方 法

1.2.1 負(fù)染色觀察

采集0.1 g具有明顯褪綠斑駁癥狀的花生葉片,置于滅菌干燥處理后的潔凈研缽內(nèi).加入500 μL的磷酸緩沖液,將葉片組織研磨至勻漿狀.轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管中,6 000 r·min-1離心3 min.取1滴上清液,用銅網(wǎng)置于液滴上吸附1 min后取出,再置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%磷鎢酸中染色10 s.使用濾紙去除多余的染色劑,并于室溫條件下放置15 min后,用透射電鏡觀察.

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序和PCR引物設(shè)計(jì)

將采集到的具有明顯斑駁褪綠癥狀的花生葉片,經(jīng)過液氮速凍處理后,送至重慶智云藍(lán)生物科技有限公司進(jìn)行RNA提取和去除rRNA非鏈特異性建庫測序.原始數(shù)據(jù)(raw reads)通過C語言腳本得到無接頭的高質(zhì)量的純凈數(shù)據(jù)(clean reads),進(jìn)而通過生物軟件CLC Genomics Workbench 9.5(QIAGEN)對clean reads進(jìn)行拼接.拼接得到的重疊群(contigs)利用BLASTn和BLASTx程序搜尋病毒同源序列,結(jié)果顯示與BCMV同源.基于contig序列設(shè)計(jì)6對引物,用于病毒的RT-PCR檢測,見表1.

表1 用于擴(kuò)增BCMV基因組的聚合酶鏈反應(yīng)引物Table 1 Polymerase chain reaction primers used for theamplication of the BCMV genome

1.2.3 病毒的RT-PCR檢測

以高通量返樣RNA為模板,使用TIANScript Ⅱ cDNA第一條鏈合成試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.主要操作如下:首先,配制14.5 μL的反應(yīng)體系,其中包含RNA 3 μL、反轉(zhuǎn)錄引物M4-T18 (10 μmol·L-1) 1 μL、超純脫氧核糖核苷三磷酸(Super Pure dNTPs, 10 mol·L-1) 1 μL、無RNA酶水(RNase-free H2O) 9.5 μL.混勻后置于65 ℃金屬浴上孵育5 min,迅速將其轉(zhuǎn)移至冰上冷卻2 min;然后,向上述溶液中加入5.5 μL的酶制劑,其中反轉(zhuǎn)錄緩沖液(5×TIANScript Ⅱ RNase Buffer) 4 μL、RNA酶抑制劑(RNasin,666.8 nkat·μL-1) 0.5 μL、反轉(zhuǎn)錄酶(TIANScript Ⅱ RTase, 3 334 nkat·μL)1 μL.混勻后置于42 ℃金屬浴上孵育60 min,迅速轉(zhuǎn)移至85 ℃金屬浴加熱 5 min以終止反應(yīng).最后,補(bǔ)充20 μL 無RNA酶水即得到cDNA,置-20 ℃冰箱保存.

以上述cDNA為模板,使用H-BCMV-1F/1R、H-BCMV-2F/2R、H-BCMV-3F/3R、H-BCMV-4F/4R、H-BCMV-5F/5R、H-BCMV-6F/M4六對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為25 μL,梯度PCR程序設(shè)定為:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s,52.4～58.5 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,設(shè)置35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min.

使用瓊脂糖凝膠電泳(100 mL電泳液里放1 g瓊脂糖)對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行目的片段檢測,使用TIANgel Midi Purification Kit普通瓊脂糖凝膠DNA試劑盒回收大小正確、條帶明亮的目的片段膠塊.得到的回收產(chǎn)物連接于pMD-18T載體(寶生物工程(大連)有限公司),并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞上培養(yǎng).挑取形態(tài)好無污染的單菌落搖床培養(yǎng)后,進(jìn)行菌液PCR再次驗(yàn)證,將陽性菌液送出測序(生工生物工程(上海)股份有限公司).

1.2.4 序列分析

使用NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)的Blast程序完成同源序列的搜索;使用DNAStar軟件內(nèi)的Clustal W程序進(jìn)行數(shù)據(jù)的同源性分析;使用Clustal_X version 1.83軟件[23]以及MEGA version 5.0軟件[24]進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建與繪制,建樹方法為最大似然法,種子重復(fù)數(shù)設(shè)置為1 000,建樹結(jié)果高于50%被顯示.

2 結(jié)果與分析

2.1 負(fù)染色觀察結(jié)果

負(fù)染色處理后的具有典型褪綠斑駁癥狀的花生病葉組織于透射電鏡下可觀察到尺寸約為15 nm×800 nm的線狀病毒顆粒,見圖2.此病毒疑似為馬鈴薯Y病毒屬病毒.

圖2 透射電鏡下的花生病葉中的病毒顆粒

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

使用6對特異引物進(jìn)行擴(kuò)增,分別得到預(yù)期大小的目的片段,檢測結(jié)果如圖3所示.六段目的片段經(jīng)過DNAMAN軟件拼接后得到10 076 bp的全基因組序列(MN786956).全基因組序列經(jīng)過ORF Finder程序查找可能的功能基因,發(fā)現(xiàn)其具有典型的Potyvirus基因結(jié)構(gòu)特征,即編碼一個長的可切割的多聚蛋白,3′端具有Poly(A)尾巴.利用Blast程序進(jìn)行搜索,發(fā)現(xiàn)其與BCMV中國武漢的大豆分離物(BCMV-[CN∶WH∶Glycine max],KJ807813)的同源性最高,達(dá)到99.3%.

圖3 BCMV的RT-PCR檢測結(jié)果Fig.3 RT-PCR detection results of BCMV

2.3 序列分析

遼寧花生樣品上BCMV分離物的CP基因?yàn)?61 bp,基于CP基因,其與已報(bào)道的BCMV各分離物同源性比對結(jié)果如表2所示.從表中可以發(fā)現(xiàn)它們的核苷酸同源性為85.6%～99.4%,氨基酸同源性為81.5%～99.7%.其中,與BCMV中國武漢的大豆分離物(KJ807813)的同源性最高,核苷酸同源性高達(dá)99.4%,氨基酸同源性高達(dá)99.7%;其次,與BCMV中國山東萊西的花生分離物(BCMV-[CN∶Arachis hypogaea],KF439722)的同源性較高,核苷酸同源性達(dá)99.2%,氨基酸同源性達(dá)99.7%.基于CP基因構(gòu)建了26個BCMV分離物的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示,BCMV主要分為兩簇,第Ⅰ簇的分離物沒有地理位置或者寄主類型的明顯限制,他們來自亞洲(中國、韓國和印度)、北美(美國)、南美(哥倫比亞)、澳洲(澳大利亞)和歐洲(德國和英國)地區(qū)的豆、豇豆、小豆、大豆、柘樹和紫椴上.第Ⅱ簇主要是BCMV的花生分離物,來自中國和美國的花生分離物均聚類在第Ⅱ簇上.此外,該簇還包括兩個大豆分離物,分別為BCMV-[SK∶Glycine max](KJ508092)和BCMV-[CN∶WH∶Glycine max](KJ807813).TMV-[USA](NC_001367)作為外群單獨(dú)聚在一個分支上,見圖4.本研究中BCMV-LN-Peanut聚集在第二簇上,與GenBank中登錄的遼寧分離物BCMV-[CN∶LN∶Peanut](MH628437)、臺灣分離物PtSV-[CN∶TW∶Peanut](AY968604)親緣關(guān)系最近.n>

表2 BCMV沈陽花生分離物與其他報(bào)道BCMV的CP基因的同源性比對結(jié)果Table 2 Percentage of nucleotide identity between CP gene of BCMV-peanut isolate of Shenyang and other published BCMV

圖4 基于CP基因構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.4 Phylogenetic tree based on CP sequences of reported BCMV

3 結(jié)論與討論

BCMV是自然條件下侵染豆科植物最為廣泛的一種植物病毒[25],近年來,在我國的快速蔓延已經(jīng)嚴(yán)重限制了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展.2017年9月,發(fā)現(xiàn)遼寧沈陽地區(qū)花生發(fā)生褪綠斑駁病害,通過利用透射電鏡對病毒粒子進(jìn)行形態(tài)觀察、轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ふ也《緛碓葱蛄幸约癛T-PCR全基因組擴(kuò)增,確定了侵染沈陽花生致其葉片呈現(xiàn)典型褪綠斑駁癥狀的病原為BCMV,這是遼寧地區(qū)首次正式報(bào)道BCMV自然存在于花生上.基于CP基因的同源性比較,發(fā)現(xiàn)其與GenBank中已經(jīng)報(bào)道的BCMV分離物的CP基因氨基酸序列相似性和核苷酸序列相似性均高于馬鈴薯Y病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)(80%或76%),則認(rèn)為是BCMV的遼寧花生分離物[10].基于CP核苷酸序列將BCMV劃分到兩個基因簇中,其中I簇包括來自不同地區(qū)不同寄主的BCMV分離物,沒有明顯的地理或者寄主分化趨勢.而Ⅱ簇中,包含了遼寧分離物在內(nèi)的各地花生分離物,它們與其他寄主上的BCMV分離物不同,在系統(tǒng)進(jìn)化過程中形成了獨(dú)立的分支,形成了明顯的株系分化趨勢.目前,關(guān)于BCMV的基因型分析主要基于CP、多聚蛋白或者全基因組序列,均發(fā)現(xiàn)BCMV的花生分離物單獨(dú)聚類,這進(jìn)一步證明了BCMV花生分離物經(jīng)歷了不同于其他豆科植物的寄主適應(yīng)性進(jìn)化[26-27].連續(xù)在遼寧地區(qū)調(diào)查花生上BCMV的發(fā)生分布和進(jìn)行種群多樣性分析,將對了解適應(yīng)性進(jìn)化的分子機(jī)制提供更多數(shù)據(jù)支持.另外,鑒于花生是遼寧農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)中僅次于玉米和水稻的第三大農(nóng)作物(2017年種植總面積為 27.17萬hm2,總產(chǎn)量高達(dá)80萬t)[28],因此,對于BCMV系統(tǒng)的調(diào)查研究可避免病毒擴(kuò)散導(dǎo)致花生產(chǎn)業(yè)甚至豆科產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重?fù)p失.