陳 熹，楊 婷，章從恩，于小紅，趙奎君，馬致潔#

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院中藥劑科，北京100052； 2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原 030001)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是全球第三大常見的惡性腫瘤，每年估計(jì)有140萬例新發(fā)確診病例和超過69萬例患者死亡[1]。在我國，CRC的發(fā)病率及死亡率一直居高不下。近十年來，化療方案的不斷完善顯著地延長了CRC患者的生存期。5-氟尿嘧啶、鉑制劑、羥基喜樹堿、長春新堿、甲氨蝶呤、紫杉醇和西妥昔單抗等被廣泛應(yīng)用于CRC的治療[2]。然而，腫瘤的多重耐藥性問題及化療藥普遍的嚴(yán)重不良反應(yīng)均對(duì)患者的治療效果有較大影響，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。

越來越多的證據(jù)表明，傳統(tǒng)中藥復(fù)方因其化學(xué)成分多樣和多靶點(diǎn)、多途徑的藥理作用等特點(diǎn)，在治療CRC方面表現(xiàn)出了巨大潛力。生姜瀉心湯收錄于《傷寒雜病論》，具有和胃消痞、散結(jié)除水的功效，目前較多用于CRC化療相關(guān)毒性的防治，改善CRC患者的預(yù)后[3]。生姜瀉心湯能夠應(yīng)用于消化系統(tǒng)惡性腫瘤及癌前病變，但其藥效機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)、蛋白組學(xué)及藥理學(xué)等，應(yīng)用高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)可視化等技術(shù)來揭示藥物、靶點(diǎn)、通路和疾病直接復(fù)雜關(guān)系的一門學(xué)科。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)藥體系整體觀念、辨證論治的觀點(diǎn)不謀而合。因此，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合，是研究發(fā)展中藥復(fù)方，明確其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的強(qiáng)有力的手段。為此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從生姜瀉心湯的物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，立足于中醫(yī)藥理論整體思想，分析其治療CRC的分子機(jī)制，同時(shí)為后續(xù)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 生姜瀉心湯藥物化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)[4]檢索生姜瀉心湯方中各味中藥。根據(jù)口服利用度(oral bioavailability，OB)≥50%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為閾值初步篩選出方中活性化合物及相關(guān)作用靶點(diǎn)，并對(duì)已發(fā)表文獻(xiàn)進(jìn)行檢索，對(duì)數(shù)據(jù)庫未收錄的活性成分進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2 CRC相關(guān)靶點(diǎn)篩選

以“colorectal cancer”“colon cancer”和“colorectal carcinoma”為關(guān)鍵詞，在OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)[5]、TTD數(shù)據(jù)庫(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)[6]和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)[7]中進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫中靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值后獲得CRC疾病靶點(diǎn)。

1.3 生姜瀉心湯-CRC靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Venny工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，將生姜瀉心湯相關(guān)靶點(diǎn)與CRC靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖。將交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)平臺(tái)(https://string-db.org)[8]，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 3.6.1軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行可視化處理，并使用內(nèi)置工具分析連接度、中介中心度及接近中心度等網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，判斷核心靶點(diǎn)發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.4 基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)的通路富集分析

運(yùn)用Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html)[9]，對(duì)生姜瀉心湯和CRC共同作用得到的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。以P<0.05為閾值，將其按P值升序進(jìn)行排序，并選取排序居前20位靶點(diǎn)的生物學(xué)過程和代謝通路。使用R語言繪制氣泡圖進(jìn)行可視化。

1.5 生姜瀉心湯-CRC-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)GO功能富集分析結(jié)果，預(yù)測(cè)治療CRC的主要靶點(diǎn)，并使用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建生姜瀉心湯-CRC-通路網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)判斷核心靶點(diǎn)發(fā)揮藥效的主要活性成分。

2 結(jié)果

2.1 生姜瀉心湯活性靶點(diǎn)

初步獲取生姜化學(xué)成分4種，甘草化學(xué)成分38種，人參化學(xué)成分7種，干姜化學(xué)成分4種，黃芩化學(xué)成分6種，半夏化學(xué)成分13種，黃連化學(xué)成分4種，大棗化學(xué)成分4種。其中4種化合物為2種或以上中藥所共有。生姜瀉心湯中各成分作用靶點(diǎn)合并去重后共獲得147個(gè)作用靶點(diǎn)，見圖1。

2.2 CRC相關(guān)靶點(diǎn)

通過檢索OMIM、TTD及GeneCards數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合已發(fā)表文獻(xiàn),合并刪除重復(fù)值后，共獲得CRC相關(guān)蛋白靶點(diǎn)1 883個(gè)。

2.3 生姜瀉心湯-CRC靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過韋恩圖發(fā)現(xiàn)生姜瀉心湯和CRC共同核心靶點(diǎn)62個(gè)，結(jié)果見圖2。將關(guān)鍵靶點(diǎn)信息提交至STRING平臺(tái)，經(jīng)過Cytoscape 3.6.1可視化后得到生姜瀉心湯PPI網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，所有關(guān)鍵靶點(diǎn)連接度平均值為23.32，中介中心度平均值為0.01，接近中心度平均值為0.62。其中，3項(xiàng)參數(shù)均高于平均值的關(guān)鍵靶點(diǎn)共13個(gè)，分別為AKT1、TP53、MAPK3、JUN、VEGFA、MAPK1、CASP3、ESR1、MMP9、PTGS2、FOS、MAPK14及AR，其可能為生姜瀉心湯治療CRC的潛在核心靶點(diǎn)。

2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)通路與功能的富集分析

應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)生姜瀉心湯治療CRC的62個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，并使用R語言繪制氣泡圖進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖4。氣泡顏色由深至淺表示-lg(P)從大到小，該值越大代表顯著性越強(qiáng)，氣泡越大則代表富集在該通路的基因計(jì)數(shù)越大；橫軸代表靶點(diǎn)富集在該通路的程度，數(shù)值越大代表富集程度越大。

GO分析結(jié)果提示，生姜瀉心湯主要參與的生物學(xué)過程(biological processes，BP)包括細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)和有機(jī)環(huán)狀化合物的應(yīng)答、類固醇激素和毒性物質(zhì)的應(yīng)答、生殖系統(tǒng)和構(gòu)造的發(fā)展變化等。相關(guān)靶點(diǎn)主要影響的分子功能(molecular functions，MF)富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、蛋白激酶結(jié)合及RNA聚合酶Ⅱ近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合等。藥物作用靶點(diǎn)涉及的細(xì)胞成分(cellular components, CC)主要富集在細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、核轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、分泌顆粒腔及RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等。生姜瀉心湯治療CRC參與的通路主要有惡性腫瘤相關(guān)通路、CRC相關(guān)通路、白細(xì)胞介素17信號(hào)通路、內(nèi)分泌耐藥通路及細(xì)胞凋亡通路等。

圖1 藥物-成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of drug-ingredients-disease targets

圖2 生姜瀉心湯-結(jié)直腸癌靶點(diǎn)韋恩圖Fig 2 Venn diagram of Shengjiang Xiexin decoction-CRC target gene

圖3 生姜瀉心湯-CRC-核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram of Shengjiang Xiexin decoction-CRC-core targets

2.5 生姜瀉心湯-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.6.1構(gòu)建生姜瀉心湯-CRC靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，使用內(nèi)置Network Analyzer程序?qū)ι獮a心湯治療CRC網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，獲得生姜瀉心湯核心成分及作用靶點(diǎn)，結(jié)果見圖5。預(yù)測(cè)黃芩素(連接度為21，中介中心度為0.078 817 27，接近中心度為0.486 590 04)、柚皮素(連接度為19，中介中心度為0.039 005 85，接近中心度為0.465 201)、刺芒柄花素(連接度為15，中介中心度為0.014 397 87，接近中心度為0.468 635)、1-甲氧基菜豆素(連接度為14，中介中心度為0.009 665 96，接近中心度為0.461 818)為生姜瀉心湯治療CRC的主要活性物質(zhì)。PTGS2在網(wǎng)絡(luò)中連接度為62，中介中心度為0.245 623 5，接近中心度為0.613 526 57，預(yù)測(cè)PTGS2為生姜瀉心湯治療CRC的最主要作用靶點(diǎn)。同樣可能在該藥理作用過程中起到重要作用的靶點(diǎn)為HSP90AA1、ESR1、AR、NOS2、PPARG、MAPK14、GSK3B、RXRA及ESR2等。

A.GO-BP分析；B.GO-MF分析；C.GO-CC分析；D.KEGG通路分析A.GO-BP analysis; B.GO-MF analysis; C.GO-CC analysis; D.KEGG-pathway analysis圖4 生姜瀉心湯治療CRC的GO功能富集及KEGG通路富集分析Fig 4 GO function enrichment and KEGG pathway enrichment analysis of Shengjiang Xiexin decoction in the treatment of CRC

圖5 生姜瀉心湯成分-CRC-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig 5 Network diagram of ingredients of Shengjiang Xiexin decoction-CRC pathway

3 討論

2007—2017年，我國是惡性腫瘤發(fā)病率增幅最大的國家，年均增幅>2%。CRC死亡率在全球惡性腫瘤中居第2位，2017年，全球CRC新發(fā)病例從130萬例增至180萬例，死亡89.6萬例。2007—2017年，CRC新發(fā)病例增加了38%[1]。隨著人們生活水平的不斷改善及生活方式的變化，特別是膳食結(jié)構(gòu)的改變，我國CRC的發(fā)病率和死亡率均呈升高趨勢(shì)，且城市地區(qū)遠(yuǎn)高于農(nóng)村。多數(shù)患者確診時(shí)已屬于中晚期。目前，針對(duì)CRC，尚沒有安全、有效的防治辦法。

在我國古代的經(jīng)方經(jīng)典中，并沒有對(duì)于“CRC”這一病名的記載。根據(jù)其癥狀及發(fā)病部位可總結(jié)歸納為“腸覃”“腸風(fēng)”“腸僻”“腸積”“鎖肛痔”及“癥瘕”等[10]。中醫(yī)認(rèn)為，CRC的病因?yàn)檎龤馓澨摷又嬍?、情志變化，從而?dǎo)致濕熱下注、氣滯血瘀，久則成疾。邱佳信總結(jié)歷代著名醫(yī)者的觀點(diǎn)，提出“有瘤必體虛，有虛首健脾”的觀念[11]。CRC的病性本虛標(biāo)實(shí)，諸多臨床案例及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CRC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵是全身氣機(jī)升降失調(diào)。以通為補(bǔ)、調(diào)暢氣機(jī)和養(yǎng)脾調(diào)胃是治療CRC的基本治則。同時(shí)，中醫(yī)“未病先防”與“病后防變”的診療思想能更好地適用于CRC的防治。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步篩選出生姜瀉心湯治療CRC的活性成分為黃芩素、柚皮素及刺芒柄花素等。治療CRC的機(jī)制基礎(chǔ)研究結(jié)果表明，黃芩素能夠誘導(dǎo)DNA片段化和染色質(zhì)凝聚，進(jìn)而阻斷腫瘤細(xì)胞周期；還能夠通過激活caspase-3和caspase-9蛋白，促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡[12]。此外，黃芩素能夠通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的活性顯著抑制細(xì)胞遷移和侵襲[13]。柚皮素可以調(diào)控Notch信號(hào)通路，影響細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的表達(dá)，抑制CRC細(xì)胞增殖、侵襲能力；并通過阻滯S期和G2/M期細(xì)胞周期，抑制人CRC細(xì)胞生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]；同時(shí)，其能夠增強(qiáng)CRC細(xì)胞對(duì)DNA藥物的敏感性[15]。刺芒柄花素通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞ERK1/2磷酸化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖分化，阻斷惡性腫瘤血管生成過程[16]。刺芒柄花素能夠調(diào)節(jié)miR-149及其直接基因靶標(biāo)EphB3的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[17]。因此，推測(cè)生姜瀉心湯治療CRC主要通過黃芩素、柚皮素和刺芒柄花素等發(fā)揮藥效。

生姜瀉心湯治療CRC的靶點(diǎn)主要集中在PTGS2。PTGS2在許多惡性腫瘤中的表達(dá)均上調(diào)。PTGS2表達(dá)上調(diào)與腫瘤細(xì)胞血管生成過程顯著相關(guān)。此外，PTGS2的代謝產(chǎn)物PGH2被前列腺素E2合酶轉(zhuǎn)化為PGE2，進(jìn)而促進(jìn)惡性腫瘤疾病進(jìn)展[18]。HSP90AA1與腫瘤細(xì)胞周期、凋亡、侵襲和分化緊密相關(guān)，是治療CRC的關(guān)鍵蛋白。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤患者體內(nèi)的HSP90AA1水平顯著升高，雖然HSP90AA1主要是細(xì)胞質(zhì)蛋白，是一種調(diào)控細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的介質(zhì)，但其影響多種核過程，包括轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重構(gòu)和DNA損傷誘導(dǎo)的突變，進(jìn)而影響腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展[19]。生姜瀉心湯治療CRC的信號(hào)通路主要集中在惡性腫瘤、CRC相關(guān)通路等。與PI3K-Akt信號(hào)通路、蛋白多糖信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡通路及IL-17信號(hào)通路等通路密切相關(guān)。CRC由結(jié)直腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生，這是特定致癌基因和抑癌基因中遺傳改變積累的結(jié)果。目前在CRC的研究中已發(fā)現(xiàn)了2種可能機(jī)制：(1)由一系列遺傳變化導(dǎo)致的染色體不穩(wěn)定性，這些變化涉及致癌基因(如K-ras)的激活和抑癌基因(如p53、DCC/Smad4及APC等)的失活[20]；(2)被稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，DNA錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1和(或)MSH2的啟動(dòng)子發(fā)生超甲基化而引起失活和編碼微衛(wèi)星的基因發(fā)生二次突變(TGF-RII、BAX等)共同導(dǎo)致這一生理過程[21]。上述2種機(jī)制均富集于PI3K-Akt信號(hào)通路。因此，推測(cè)生姜瀉心湯可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路從而發(fā)揮治療CRC的作用。

本研究結(jié)果表明，生姜瀉心湯能夠調(diào)控多種CRC相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)而參與并影響不同的生物學(xué)過程及信號(hào)通路，體現(xiàn)了傳統(tǒng)中醫(yī)藥多功能、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)和作用特點(diǎn)。本研究結(jié)果為目前臨床治療CRC提供了一條嶄新的思路，并為探討生姜瀉心湯用于防治CRC的潛在作用機(jī)制提供了新的方向。但是，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究藥物治療疾病的靶點(diǎn)仍存在局限性，目前尚未有基礎(chǔ)研究驗(yàn)證其可靠的相關(guān)性。因此，后續(xù)將根據(jù)本研究結(jié)果，更進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)、體外試驗(yàn)驗(yàn)證，明晰生姜瀉心湯治療CRC的藥理作用及相關(guān)機(jī)制。