劉萬好，于素珍，2，肖慧琳，鄭秋玲，宋建強，宋志忠，宮 磊，唐美玲，2

（1.山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺 265500；2.煙臺大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264005；3.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264025；4.山東省葡萄研究所，山東 濟南 250100）

葡萄（Vitis vinifera）是世界上最重要的果樹之一，分布在世界各地，種植面積超過750萬hm2，世界葡萄產(chǎn)量39%分布在歐洲，亞洲32%，美洲20%[1]，但葡萄易感染病毒病，如葡萄卷葉病毒、葡萄扇葉病毒、沙地葡萄莖痘病毒等。各國都在注重葡萄病毒病的研究[2]，目前，在全世界不同的葡萄品種中已記錄了約70種葡萄病毒和類病毒[3]，國外正在積極使用高通量測序和宏基因組學(xué)技術(shù)對葡萄病毒生態(tài)進(jìn)行持續(xù)的全面研究[4-5]。而我國20世紀(jì)80年代后才開始研究葡萄病毒病[6]，當(dāng)前記錄了約20種葡萄病毒病[7]，葡萄卷葉病毒中僅對葡萄卷葉病毒2（grapevine leaf-roll virus 2，GLRaV-2）與葡萄卷葉病毒3（grapevine leaf-roll virus 3，GLRaV-3）的研究較多，對其他病原的研究不足[8]。

煙臺是全國著名的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，釀酒葡萄栽培面積約為1萬hm2，主栽品種為8個，蛇龍珠是主栽品種之一，面積約為0.133萬hm2。調(diào)查發(fā)現(xiàn)蛇龍珠普遍存在葡萄卷葉病，即葉片反卷變紅現(xiàn)象，發(fā)生率為51.31%～66.26%。本研究通過田間癥狀調(diào)查，將蛇龍珠分為葉片反卷和葉片正常兩組，擬研究葉片反卷變紅癥狀對蛇龍珠果實風(fēng)味物質(zhì)累積和果實品質(zhì)的影響，同時利用小核糖核酸（small ribonucleic acid，sRNA）測序技術(shù)對兩組植株進(jìn)行病毒病原鑒定，為培育無病毒蛇龍珠苗木和配套精準(zhǔn)化栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛇龍珠葡萄：蓬萊產(chǎn)區(qū)中糧釀酒葡萄基地。株行距為1 m×2 m，單干單臂＋直立葉幕整形。

氫氧化鈉、葡萄糖、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞甲基藍(lán)、鹽酸、氯化鉀、無水乙酸鈉、甲醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、沒食子酸、磷鉬酸與無水乙醇等（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；MDF-382E超低溫冰箱：日本三洋電氣集團；H13237型超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；Centrifuge5430R高速離心機：德國Eppendorf公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 采樣

2018年在蛇龍珠葡萄果實成熟時，田間調(diào)查標(biāo)記出帶有葉片反卷癥狀和非葉片反卷癥狀的葡萄各20株，從葡萄座果期開始分期采樣，于2019年7月8日，7月17日，8月14日，8月29日，9月19日和9月29日在兩組葡萄樹的不同部位隨機選取各10穗健康葡萄果穗，置于裝有冰袋的泡沫箱帶回實驗室備用；隨機在兩組葡萄樹體上的陰陽兩面、果穗上、中、下選取500粒健康果粒，部分直接放入-40 ℃冰箱貯存?zhèn)溆茫糜跍y定果實還原糖與可滴定酸；部分剝?nèi)∑涔ず蠓湃胍旱賰觯心コ煞?，保存?80 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分析檢測

蛇龍珠葡萄果實還原糖測定采用斐林試劑滴定法[9]；可滴定酸測定采用滴定法[9]；單寧測定采用福林丹尼斯法[9]；總酚測定采用福林-肖卡法[10]；花色苷測定采用pH示差法[11]。各選取卷葉和正常的10棵蛇龍珠，每棵葡萄剪取5根枝條，取其韌皮部，用錫箔紙包裹好并用液氮速凍，用干冰寄往上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，采用illumina HiSeqTM2500/MiSeq進(jìn)行高通量測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小核糖核酸（sRNA）測序質(zhì)量評估

葉片反卷癥狀（V：病株）sRNA和非葉片反卷癥狀（N：正常）的葡萄進(jìn)行測序，結(jié)果見表1。由表1可知，正常葉片的蛇龍珠原始數(shù)據(jù)為21 300 061，葉片反卷變紅的蛇龍珠原始數(shù)據(jù)為22 625 415，過濾掉原始數(shù)據(jù)中不合格的測序序列（reads）后，得到有效數(shù)據(jù)表現(xiàn)正常的蛇龍珠為21 067 763，有癥狀表現(xiàn)的蛇龍珠為22 373 700，有效率分別為98.91%與98.89%。測序錯誤率僅為0.01%。結(jié)果說明2個樣品的測序質(zhì)量較高，其獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可滿足后續(xù)分析的需要。

表1 樣品sRNA測序數(shù)據(jù)評估Table 1 Data evaluation of small RNA sequencing of samples

2.2 小核糖核酸（sRNA）測序病毒篩選

由于病毒感染的植物，大量積累21nt、22nt和24nt病毒短干擾siRNA（short interfering RNA，siRNAs）[12]，因此對上述得到的有效數(shù)據(jù)（clean reads），篩選堿基長度18～26 bp的sRNA來進(jìn)行后續(xù)分析，結(jié)果見表2。由表2可知，兩種處理sRNA總數(shù)和種類都不同：正常的蛇龍珠sRNA總數(shù)和種類分別為14 036 456和1 311 537；卷葉的蛇龍珠sRNA總數(shù)和種類分別為15 839 145和1 532 668。

表2 樣品sRNA種類與數(shù)量Table 2 Types and quantities of sRNA of samples

2.3 小核糖核酸（sRNA）測序鑒定卷葉蛇龍珠病毒種類

將有癥狀與無癥狀的樣品拼接結(jié)果進(jìn)行分類注釋，檢測其病毒分布情況，結(jié)果見表3。由表3可知，無癥狀表現(xiàn)植株共766個片段（contigs），其中有153個注釋到非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫，703個注釋到核酸序列數(shù)據(jù)庫，3個注釋到病毒核酸數(shù)據(jù)庫，10個注釋到病毒蛋白數(shù)據(jù)庫，554個注釋到宿主基因組序列數(shù)據(jù)庫。有癥狀表現(xiàn)的植株共1 087個contigs，其中有212個注釋到非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫，1 023個注釋到核酸序列數(shù)據(jù)庫，136個注釋到病毒核酸數(shù)據(jù)庫，82個注釋到病毒蛋白數(shù)據(jù)庫，728個注釋到宿主基因組序列數(shù)據(jù)庫。

表3 病毒注釋結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Statistics results of virus annotated

葉片正常的蛇龍珠中，只在非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中被注釋到沙地葡萄莖痘病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）一種病毒，contigs數(shù)為2，兩種類病毒分別是葡萄黃斑類病毒（grapevine yellow speckle viroid 1，GYSVd-1）和啤酒花矮化類病毒（hop stunt viroid，HSVd）等類病毒。葉片反卷的蛇龍珠中，共檢測出7種已知葡萄病毒：分別是葡萄卷葉病毒3（grapevine leafroll-associated virus 3，GLRaV-3）、葡萄卷葉病毒2（grapevine leafroll-associatedvirus 2，GLRaV-2）、灰比諾病毒（grapevinePinotgrisvirus，GPGV）、沙地葡萄莖痘病毒、葡萄根莖損壞相關(guān)病毒（grapevine rootstock stem lesion associated virus，GRSLaV）、葡萄病毒E（grapevine virus E，GVE）和葡萄斑點病毒（grapevine fleck virus，GFkV）。

在核酸序列數(shù)據(jù)庫中被注釋到的病毒最多，葡萄卷葉病毒3 contigs數(shù)為28，葡萄卷葉病毒2 contigs數(shù)為105，灰比諾病毒contigs數(shù)為1，沙地葡萄莖痘病毒contigs數(shù)為4，葡萄根莖損壞相關(guān)病毒contigs數(shù)為3，葡萄病毒E contigs數(shù)為1，葡萄斑點病毒contigs數(shù)為1。類病毒有葡萄黃斑類病毒1 contigs數(shù)為1，葡萄黃斑類病毒2（Grapevine yellow speckle viroid 2，GYSVd-2）contigs數(shù)為1，酒花矮化類病毒contigs數(shù)為2，葡萄錘頭狀類病毒contigs數(shù)為4。

在非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫中，注釋到葡萄卷葉病毒3 contigs數(shù)為2，葡萄卷葉病毒2 contigs數(shù)為9，沙地葡萄莖痘病毒contigs數(shù)為1，葡萄根莖損壞相關(guān)病毒contigs數(shù)為13，未注釋到葡萄類病毒。1種不知名病毒Lausannevirus，contigs數(shù)為1。

在病毒核酸數(shù)據(jù)庫中注釋到葡萄卷葉病毒3 contigs數(shù)為22，葡萄根莖損壞相關(guān)病毒contigs數(shù)為107，葡萄斑點病毒contigs數(shù)為1，葡萄病毒E contigs數(shù)為1，灰比諾病毒contigs數(shù)為1。未注釋到葡萄類病毒。2種不知名病毒Tadarida brasiliensis circovirus 1 contigs數(shù)為1，Choristoneura occidentalis granulovirus contigs數(shù)為1。

在病毒蛋白數(shù)據(jù)庫中注釋到葡萄卷葉病毒3 contigs數(shù)為9，葡萄卷葉病毒2 contigs數(shù)為5，葡萄斑點病毒contigs數(shù)為1，葡萄根莖損壞相關(guān)病毒contigs數(shù)為53，沙地葡萄莖痘病毒contigs數(shù)為1，未注釋到葡萄類病毒。有大量不知名病毒。

2.4 卷葉對蛇龍珠果實風(fēng)味物質(zhì)累積的影響

如圖1所示，蛇龍珠葉片自7月初基部葉片開始反卷，隨著時間的推移，反卷葉片逐漸上移，同時葉脈之間開始出現(xiàn)斑點，逐漸變紅。

圖1 不同采樣時期蛇龍珠葡萄葉片反卷與變紅程度Fig.1 Reverse winding and reddening degree of grape leaves in different sampling periods

如表4所示，反卷葉片蛇龍珠的還原糖、總酚風(fēng)味物質(zhì)累積動態(tài)與正常植株基本保持一致，自7月8日開始一直處于含量增加狀態(tài)，到果實成熟采收時含量達(dá)到最大；但與正常植株相比，其含量顯著減少（P＜0.05）。自7月17日第二次采樣一直到成熟采收的5次采樣測定，反卷葉片的蛇龍珠還原糖含量與對照相比一直都是顯著降低（P＜0.05），其中7月17日降低最明顯，減少24.05%；反卷葉片的蛇龍珠總酚含量一直都低于正常植株，只有兩次含量（7月8日和9月29日）差別達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其中7月8日降低最明顯，減少36.90%。

表4 蛇龍珠葡萄果實風(fēng)味物質(zhì)含量檢測結(jié)果Table 4 Determination results of flavor substance content in Cabernet Gernische grape

反卷葉片蛇龍珠的花色苷累積動態(tài)與正常植株基本一致，含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但總量較剛開始測定時要多。反卷葉片蛇龍珠的花色苷含量一直是低于正常植株，8月14日和8月29日含量達(dá)到顯著差異，其中8月4日降低最明顯，減少47.64%。

反卷葉片蛇龍珠可滴定酸累積動態(tài)與正常植株不太一致，雖然總體趨勢是逐漸減少，8月14日之前，含量一直比正常植株低，自8月14日開始含量高于正常植株，是正常植株的1.4倍，一直到采收，與正常植株相比都是顯著性增加（P＜0.05）。

反卷葉片蛇龍珠單寧累積動態(tài)與正常植株不同，含量是增加到8月29日達(dá)到最大值，隨后小幅度減少，但至采收前基本恢復(fù)到8月29日含量。正常植株單寧含量先增加到8月29日達(dá)到最大值，隨后含量減少。葉片反卷蛇龍珠單寧含量8月29日和9月19日比正常含量減少，但幅度不明顯，9月29日果實采收時是正常植株的1.41倍。

3 討論

通過sRNA高通量測序鑒定植物攜帶病毒種類是最新的病毒病原鑒定方法，目前已經(jīng)在蘋果、葡萄等果樹上應(yīng)用。高通量同時對幾十萬到幾百萬條脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分子測序，能夠檢測到樣本中已知和未知的病毒[13]，現(xiàn)在有很多新病毒是通過該方法獲得的，國外目前也是較多的使用此方法。sRNA測序其原理為植物體內(nèi)的RNA沉默機制，通過分離特定大小的RNA分子進(jìn)行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的微小核糖核酸（microRNA，miRNA）分子，鑒定出相關(guān)病毒[14]。下一代測序技術(shù)的出現(xiàn)使宏基因組學(xué)成為植物病毒學(xué)的一種可能方法，拓寬了診斷的潛力，并加深了對感染葡萄的病毒病原體的認(rèn)識[15]。本研究通過sRNA測序鑒定出煙臺產(chǎn)區(qū)葉片反卷的蛇龍珠攜帶7種已知病毒，4種類病毒和多種未知病毒，其中包括能夠促進(jìn)葉片反卷的卷葉病毒3與卷葉病毒2。而正常植株只攜帶1種病毒和2種類病毒?？梢缘贸鰺熍_產(chǎn)區(qū)蛇龍珠帶毒情況嚴(yán)重，至于單株攜帶病毒種類以及哪些病毒導(dǎo)致葉片反卷以及紅斑不同需要進(jìn)一步深入研究。比起常規(guī)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse trans-cription-polymerase chain reaction，RT-PCR），其檢測結(jié)果更精確，不僅確定了病毒種類，還確定了類病毒種類以及未知的病毒。

通過前期的田間調(diào)查和田間測定發(fā)現(xiàn)由于攜帶多種病毒和類病毒，葉片反卷植株樹體生長減緩，但也能較好的控制蛇龍珠旺長，導(dǎo)致結(jié)果枝百分率和每結(jié)果枝果穗數(shù)明顯增加，HALLDORSON M M等[16]也檢測到植株感染葡萄卷葉病毒后芽活力下降。這對于生產(chǎn)者來說是件好事，因為煙臺產(chǎn)區(qū)蛇龍珠普遍存在旺長現(xiàn)象，需要長梢修剪，否則結(jié)果枝率偏低。

但通過室內(nèi)測定指標(biāo)發(fā)現(xiàn)卷葉植株大部分風(fēng)味物質(zhì)累積動態(tài)趨勢與正常植株比較一致，而原糖、總酚、花色苷含量與正常植株相比顯著減少，這與目前AKBAS,B等[17-20]有關(guān)葡萄卷葉病研究表明的卷葉病對果實品質(zhì)影響的結(jié)果一致。而本研究測得單寧前期保持不變，隨后經(jīng)歷了先降低后升高，這與ALABI B等[21]在對梅鹿輒為試材連續(xù)三年的研究結(jié)果相同。唯一不同的是可滴定酸含量比正常植株增加，也就是說葉片反卷植株降酸較慢，這在生產(chǎn)上對于煙臺產(chǎn)區(qū)來說又是一個好現(xiàn)象，因為釀酒者普遍反應(yīng)蛇龍珠這個品種降酸太快。

4 結(jié)論

本研究明確了葉片反卷變紅蛇龍珠的主要病毒和類病毒種類，攜帶7種已知病毒與4種類病毒和多種未知病毒，并且對果實品質(zhì)影響較大，反卷葉片的蛇龍珠還原糖含量顯著降低，其中7月17日降低最明顯，減少24.05%；總酚含量一直都低于正常植株，7月8日降低最明顯，減少36.90%；花色苷含量在8月4日降低最明顯，減少47.64%；單寧累積動態(tài)與正常植株不同。葡萄一旦感染病毒，便終身帶毒，因此一定要培育并采用蛇龍珠無毒苗木，確保葡萄產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展。