張相鑫

摘 ?要：植物和微生物產(chǎn)生的植酸酶可催化難溶性植酸水解釋放磷酸鹽，從而使動(dòng)物更容易獲得磷酸鹽。本文對(duì)植酸酶的特點(diǎn)、生化特性及應(yīng)用領(lǐng)域和前景進(jìn)行論述。在動(dòng)物飼料中添加植酸酶可提高食品生產(chǎn)動(dòng)物的產(chǎn)量，且不會(huì)增加礦物磷酸鹽的額外成本。土壤中的植酸酶可減少水體富營養(yǎng)化風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：植酸;植酸酶;肌醇磷酸鹽;植酸酶生產(chǎn)商;植酸酶的應(yīng)用

2 ?植酸酶的特性

植酸酶屬于磷酸酶類（EC 3.1.3.），可催化植酸鹽水解去除無機(jī)磷酸鹽。這些酶主要來自植物、細(xì)菌和真菌。許多種類的細(xì)菌和真菌含有3-植酸酶（EC 3.1.3.8），該酶從植酸第3個(gè)碳原子上的磷酸基團(tuán)開始水解。植物和大腸埃希菌均可表達(dá)6-植酸酶（EC 3.1.3.26），其首先水解第6個(gè)碳原子上的化學(xué)鍵。3-植酸酶水解的終產(chǎn)物是L-肌醇-2-磷酸酯，而6-植酸酶可使底物完全去磷酸化。此外，研究人員也鑒定出了5-植酸酶（EC 3.1.3.72），該酶從第5個(gè)碳原子處啟動(dòng)磷酸分解反應(yīng)。研究表明，酪氨酸磷酸酶（PTPLP）也具有植酸酶活性，可以使用肌醇多磷酸鹽作為底物。肌醇多磷酸鹽的水解從肌醇的第3個(gè)或第4個(gè)碳原子開始，形成磷酸鹽和肌醇-1，2-二磷酸。

根據(jù)結(jié)構(gòu)和催化植酸磷酸鹽分解機(jī)制的不同，植酸酶可被分為組氨酸酸性磷酸酶（Histidine Acidic Phosphatases，HAPs）、β-螺旋植酸酶（β-Propelleric Phytases，BPPs）、紫色酸性磷酸酶（Purple Acidic Phosphatases，PAPs）和具有植酸酶活性的酪氨酸磷酸酶。

HAPs含有保守的組氨酸氮端（N-）和碳端（C-）。在催化過程中，酶的N-端和C-端彼此靠近形成催化中心，磷酸的兩步分解發(fā)生在該催化中心。大多數(shù)細(xì)菌和部分真菌如枝孢菌屬（Cladosporium sp.）、黑曲霉菌（Aspergillus niger）、泡盛曲霉菌（Aspergillus awamori）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）能夠分泌HAPs。曲霉屬（Aspergillius sp.）的植酸酶被廣泛用作豬和家禽的飼料添加劑。HAPs在酸性介質(zhì)（最適pH為4.5～6.0）中具有活性。在此條件下，植酸鹽失去金屬離子成為植酸，植酸與植酸酶帶正電荷的催化中心親和。用螯合劑去除金屬離子可提高植酸酶的活性。HAPs可非特異性水解磷酯，如ATP、AMP、果糖-1，6-二磷酸、葡萄糖-6-磷酸和對(duì)硝基苯酚磷酸鹽等。并非所有的HAPs都有植酸酶活性。

BPPs（EC 3.1.3.8）廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物中。該植酸酶因具有特殊的空間結(jié)構(gòu)而得名，它們擁有一種類似六葉螺旋槳的結(jié)構(gòu)。BPPs還包括一些堿性植酸酶，這些酶在pH大于7時(shí)水解植酸。堿性植酸酶最先在地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）中被鑒定出。植物[如寬葉香蒲（Typha latifolia）和百合（Lilium longixorum）等]的花粉中也發(fā)現(xiàn)了堿性BPPs。研究人員在土壤細(xì)菌如淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和左乳酸芽孢桿菌（Bacillus laevolacticus）中發(fā)現(xiàn)了胞外堿性植酸酶。堿性植酸酶的X射線結(jié)構(gòu)分析不僅顯示了它們的特殊結(jié)構(gòu)，還顯示了兩個(gè)磷酸基團(tuán)和六個(gè)鈣離子可能結(jié)合的氨基酸形成位點(diǎn)。鈣離子在這個(gè)反應(yīng)中作為輔助因子。

顯然，植酸酶可參與微生物的某些生理反應(yīng)。BPPs敲除的枯草芽孢桿菌菌株的生長(zhǎng)效率降低，尤其是在pH、溫度和鹽濃度未達(dá)到最適水平的情況下。

細(xì)菌、真菌和動(dòng)物均能分泌PAPs，其中以植物的最為廣泛。PAPs因呈現(xiàn)粉紅色或紫色而得名，這是由于它們的催化中心含有Fe3+，其他金屬離子還有鋅（也參與催化）、二價(jià)鐵和錳。該P(yáng)APs主要結(jié)構(gòu)還包括參與金屬螯合的保守性氨基酸序列。植物基因組含有許多被鑒定為PAPs編碼基因的基因。然而，并不是所有的PAPs都具有植酸酶活性。這表明這些植酸酶不僅參與磷酸鹽、肌醇和金屬離子的代謝，還具有一些其他功能。試驗(yàn)表明，PAPs參與植物抵抗熱應(yīng)激、氧化應(yīng)激和鹽化應(yīng)激等過程，還具有過氧化物酶活性。

PTPLPs也被稱為半胱氨酸植酸酶，其活性中心擁有CX5R（S/T）結(jié)構(gòu)域，它需要結(jié)合參與水解的磷酸。PTPLPs不能識(shí)別酪氨酸磷酸酶的特有底物。該酶最早從反芻動(dòng)物瘤胃中的反芻獸月形單胞菌和埃氏巨型球菌中分離得到。從δ-變形桿菌噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）分離的PTPLP對(duì)肌醇六磷酸酯具有高度特異性。

3 ?植酸酶活性的檢測(cè)方法

植酸酶活性既可以利用微生物學(xué)方法測(cè)定，也可以利用化學(xué)方法測(cè)定。前一種方法基于微生物能在以植酸為唯一磷源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng);化學(xué)方法則根據(jù)最終反應(yīng)產(chǎn)物的濃度測(cè)量，即無機(jī)磷酸鹽或磷酸肌醇衍生物的濃度。微生物學(xué)方法可以篩查細(xì)菌和真菌是否具有植酸酶活性。但是，這些方法比較耗時(shí)，且只能提供植酸酶活性的粗略值。因此還需要利用其他方法來估算其活性，并揭示反應(yīng)機(jī)制。

目前廣泛應(yīng)用的測(cè)定無機(jī)磷酸鹽（inorganic Phosphate，Pi）濃度的分光光度法基于Fiske和Subbarow在1925年提出的方法。在該方法中，反應(yīng)產(chǎn)物（Pi）在酸性介質(zhì)中與鉬酸銨相互作用，形成可吸收355 nm波長(zhǎng)光的黃色鉬酸。一些改進(jìn)方法將鉬酸進(jìn)一步還原為鉬藍(lán)，其濃度可用分光光度法（波長(zhǎng)700 nm）測(cè)量。該反應(yīng)會(huì)用多種化合物作為還原劑，包括1-氨基-2-萘酚-4-磺酸、硫酸鐵、抗壞血酸和氯化錫。高效離子色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）無需更改就可用于估算無機(jī)磷酸鹽濃度?；跓o機(jī)磷酸鹽形成來估算植酸酶活性的方法有一個(gè)重大缺點(diǎn)，即研究樣品中存在其他磷酸酶，隨著含磷酸鹽化合物水解的增多，機(jī)體無機(jī)磷酸鹽儲(chǔ)備可能增加。因此，研究人員已經(jīng)開發(fā)出一種高靈敏度方法，用于估算產(chǎn)物色譜分離后的植酸酶活性，并利用肌醇脫氫酶定量測(cè)定肌醇的水平。

利用HPLC可以對(duì)底物水解過程中產(chǎn)生的磷酸肌醇衍生物進(jìn)行鑒定，還可以確定植酸分子中磷酸鹽開始水解的位置，同時(shí)追溯整個(gè)水解過程，并明確其最終產(chǎn)物的特征?；诟咝б合嗌V法提出的方法是為了分析磷酸肌醇衍生物[40]。

研究人員以植酸-溶菌酶復(fù)合物為底物，開發(fā)出了一種可以快速估算堿性BPPs和HAPs包括3-植酸酶和6-植酸酶活性的方法。

（未完待續(xù)）

原題名：Phytases and the prospects for their application （Review）（英文）

原作者：N. N. Gessler等（俄羅斯）