文鍇 張雷 王清明 徐旋 王璐璐

摘要? ? 為了研究不結(jié)球白菜霜霉病菌菌株生物學(xué)特征及致病力，以10份不結(jié)球白菜霜霉病病變?nèi)~為材料，收集、提取、培養(yǎng)并保存霜霉病菌菌株，測定菌株生物學(xué)特性，調(diào)查其病情指數(shù)。結(jié)果表明，當(dāng)溫度為6～25 ℃時，孢子囊均可萌發(fā)，18 ℃萌發(fā)率達(dá)到最大值;在相對濕度為98%～100%條件下，孢子囊均可萌發(fā);在相對濕度為100%條件下，孢子囊萌發(fā)率達(dá)到最大值，在48 h萌發(fā)率達(dá)到最大。南京地區(qū)霜霉病菌孢子囊相對較大，天津地區(qū)霜霉病菌孢子囊相對較小。不結(jié)球白菜品種042-S2-1病情指數(shù)為4.80，為高抗;品種084-S2-6病情指數(shù)為68.15，為感病。Cc-nj2的侵染能力最強，Cc-nj3的侵染能力最弱。綜合分析可知，不結(jié)球白菜品種042-S2-1和027-S2-1為抗病材料，084-S2-6為感病材料。

關(guān)鍵詞? ? 不結(jié)球白菜霜霉病;生物學(xué)特性;孢子囊;病情指數(shù);致病力

中圖分類號? ? S435.121.4+5? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）21-0131-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

不結(jié)球白菜又叫青菜、小白菜，生長周期短、產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣、種類繁多，對調(diào)節(jié)蔬菜市場供應(yīng)具有重要作用。在多年的栽培生產(chǎn)過程中，不結(jié)球白菜病害高發(fā)，其中黑斑病、白粉病、霜霉病對產(chǎn)量影響較大。霜霉菌（Hyaloperonospora parasitica）是引起不結(jié)球白菜霜霉病的病原菌，霜霉病是不結(jié)球白菜生產(chǎn)上的一大病害，主要危害葉片，影響葉肉品質(zhì)，尤其是影響苗期生長。不結(jié)球白菜霜霉病具有高發(fā)病率、強傳染性等特點，大大降低了不結(jié)球白菜的產(chǎn)量，嚴(yán)重制約了我國不結(jié)球白菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)國內(nèi)外有關(guān)報道，不同不結(jié)球白菜品種對霜霉病存在明顯抗性差異，菌株對不同蔬菜品種的侵染能力存在明顯差異，霜霉病伴隨不結(jié)球白菜整個生長周期[1]。在春、秋季節(jié)，不結(jié)球白菜霜霉病菌株的致病能力比夏、冬季節(jié)更強。由于霜霉病菌株進(jìn)化快速[2]，化學(xué)殺菌劑對于新進(jìn)化的霜霉病病菌的防治效果較差[3-4]。目前，通過對蔬菜的抗性基因研究和培育不結(jié)球白菜抗病品種是防治霜霉病最為有效的方法。由于蔬菜抗性較差，田間管理者為了降低霜霉病危害，通常每5～7 d噴施1次殺菌劑[5]。由于抗殺菌劑菌株群體緩慢出現(xiàn)，田間管理者將面對新的抗病難題[6]。致病型的真菌性狀在蔬菜上呈現(xiàn)很多不同的特點，形態(tài)學(xué)上的差異給病原菌的鑒定與分類工作增加了難度，而霜霉菌侵染能力受其生理機(jī)制的影響?；诖?，本文通過對不結(jié)球白菜霜霉病菌株生物學(xué)特性及致病力的研究，進(jìn)一步探究不結(jié)球白菜品種的抗病性。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 供試材料

供試不結(jié)球白菜品種為027-S2-1、SZQ、042-S2-1、084-S2-6和NHCC-020-S2-2。供試霜霉病菌株分別來自沈陽、天津和南京等地（表1），病葉采集后裝于無菌密封箱，帶回實驗室備用，共計10份。收集的病菌要求未施用殺菌劑，且純凈、新鮮、無雜菌。采集病葉后，用蒸餾水沖洗3～4次，在18～25 ℃暗培養(yǎng)箱中保濕24～48 h，待出現(xiàn)新鮮且濃密的霜霉菌層，備用。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 孢子囊懸浮液制備。用滅菌的蒸餾水將采集的病葉表面污垢雜質(zhì)沖洗干凈后，用滅菌的濾紙充分吸干葉面水分，在溫度18 ℃、濕度為100%的全黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。培養(yǎng)后用滅菌的毛筆輕輕刷下新鮮孢子囊，溶解到滅菌蒸餾水中配制孢子囊懸浮液。

1.2.2? ? 不結(jié)球白菜霜霉病病菌孢子囊萌發(fā)方式。參照改進(jìn)后崔鐵軍等[7]的方法，吸取少量新鮮孢子囊懸浮液制片，于顯微鏡下統(tǒng)計觀察。

1.2.3? ? 不結(jié)球白菜霜霉病病菌生物學(xué)特性測定。

（1）溫度對不結(jié)球白菜霜霉病病菌孢子囊萌發(fā)的影響。將新鮮孢子囊懸浮液分別置于0、6、12、16、18、22、25 ℃條件下，于4、8、12、16、24 h后分別檢測萌發(fā)率，每個處理3次重復(fù)。

（2）相對濕度對不結(jié)球白菜霜霉病病菌孢子囊萌發(fā)的影響。采集的病葉用蒸餾水沖洗干凈后，置于溫度為18 ℃，相對濕度分別為90%、95%、98%、100%的條件下培養(yǎng)。待長出菌層，于培養(yǎng)4、8、16、24、36、48 h分別顯微鏡制片檢測孢子囊萌發(fā)率，每個處理3次重復(fù)。

1.2.4? ? 不結(jié)球白菜霜霉病菌形態(tài)學(xué)觀察。將每個品種的菌株分別置于光學(xué)顯微鏡和體式顯微鏡下觀察。每個菌株在10×40倍顯微鏡下用顯微測微尺隨機(jī)測定，孢子囊數(shù)量不少于50個，計算孢子囊大小。

1.2.5? ? 不結(jié)球白菜霜霉菌致病性研究。把菌源Cc-nj1分別接種于不結(jié)球白菜品種027-S2-1、SZQ、084-S2-6和042-S2-1。同時，于SZQ上分別接種菌源Cc-tj1、Cc-sy1、Cc-nj2和Cc-nj3，于NHCC-020-S2-2上接種菌源Cc-nj4和Cc-tj1，子葉期接種7 d后，肉眼結(jié)合體視顯微鏡進(jìn)行觀察統(tǒng)計，調(diào)查病情指數(shù)，于各品種不結(jié)球白菜子葉期以注射器注射的方式接種菌種。結(jié)果調(diào)查按葉片的病斑面積分級，記錄病情指數(shù)。改良后的分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，無病斑;1級，病斑微小，病斑面積占葉面積20%及以下;3級，病斑較大且面積占葉面積的20%～40%;5級，病斑面積占葉面積的40%～60%，病斑大且多;7級，病斑面積占葉面積的60%及以上，病斑多，存在局部壞死現(xiàn)象[8]。病情指數(shù)計算公式如下：

依病情指數(shù)（DI）將不結(jié)球白菜對霜霉病的抗性分為以下5級：高抗（HR），DI≤20;抗?。≧），2080。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 不結(jié)球白菜霜霉菌形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)觀察

通過霜霉菌的形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，不結(jié)球白菜霜霉菌孢子梗有明顯主干，存在分支，分支發(fā)達(dá)、細(xì)長且相互交織，孢子囊位于頂端且形成芽管，芽管可形成分支（圖1），孢子囊呈球形或橢球形（圖2）。

2.2? ? 溫度對不結(jié)球白菜霜霉菌孢子囊萌發(fā)的影響

在供試范圍溫度內(nèi)，0 ℃條件下未發(fā)現(xiàn)孢子囊萌發(fā)，6～25 ℃均有孢子囊萌發(fā)，但6 ℃條件下前12 h未發(fā)現(xiàn)孢子囊萌發(fā)。孢子囊萌發(fā)率隨溫度升高呈先升后降的趨勢，18 ℃條件下萌發(fā)率達(dá)到最大值（表2）。較高或較低的溫度都會降低霜霉菌孢子囊的萌發(fā)率。

2.3? ? 相對濕度對不結(jié)球白菜霜霉菌孢子囊萌發(fā)的影響

在供試相對濕度范圍內(nèi)，在相對濕度95%以下，孢子囊不萌發(fā);在相對濕度98%～100%條件下，孢子囊均可萌發(fā)。相對濕度98%和100%條件下，孢子囊萌發(fā)率存在較大差異。在相對濕度100%條件下，孢子囊萌發(fā)率達(dá)到最大值，且在48 h萌發(fā)率達(dá)到最大（表3）。

2.4? ? 不結(jié)球白菜霜霉菌孢子囊大小

從表4可以看出，南京地區(qū)霜霉菌孢子囊平均大小為22.02～32.57 μm×22.15～31.76 μm;天津地區(qū)孢子囊平均大小為19.17～22.55 μm×19.99～22.29 μm。綜合比較可知，南京地區(qū)霜霉菌孢子囊相對較大，天津地區(qū)霜霉菌孢子囊相對較小。

2.5? ? 不結(jié)球白菜霜霉菌致病性

由表5可以看出，根據(jù)子葉期發(fā)病情況，不同不結(jié)球白菜品種間發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)有明顯差異，發(fā)病率為4.80%～100.00%，病情指數(shù)為4.80～87.14。高抗品種為042-S2-1，病情指數(shù)為4.80;感病品種為084-S2-6，病情指數(shù)為68.15。Cc-nj2的侵染能力最強，使SZQ發(fā)病指數(shù)達(dá)87.14;Cc-nj3的侵染能力較弱，使SZQ發(fā)病指數(shù)為28.42。綜合分析可知，不結(jié)球白菜042-S2-1和027-S2-1為抗病品種，084-S2-6為感病品種。

由表5可以看出，所有不結(jié)球白菜品種均可感染霜霉病菌。同一品種霜霉菌菌株對不同鑒別寄主的致病能力存在差異;不同霜霉菌菌株對同一種寄主的侵染力和致病性都存在差異。綜合分析可知，不同區(qū)域的不結(jié)球白菜霜霉菌存在生理小種分化現(xiàn)象。

3? ? 結(jié)論與討論

霜霉菌傳播主要以風(fēng)為載體，主要寄生在葉片上，無性繁殖，適宜的溫度和濕度有利于霜霉菌生長。對于不結(jié)球白菜霜霉病病原菌的防治，菜農(nóng)多采用多菌靈治理，但效果不佳?；诖耍驹囼灳筒煌瑴囟群拖鄬穸鹊拳h(huán)境因素對不結(jié)球白菜霜霉病病原菌孢子囊萌發(fā)率的影響進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)，在供試條件下，孢子囊在6～25 ℃范圍內(nèi)均有萌發(fā)，但6 ℃條件下孢子囊萌發(fā)率低且前12 h未發(fā)現(xiàn)萌發(fā)，18 ℃為孢子囊萌發(fā)的最適溫度，較高或較低溫度都會使霜霉菌孢子囊的萌發(fā)力有一定程度下降。南京地區(qū)不結(jié)球白菜霜霉病高發(fā)于4月前后，這可能與18 ℃的最適溫度有關(guān)。在供試相對濕度條件范圍內(nèi)，孢子囊在相對濕度為95%及以下基本不萌發(fā);相對濕度為 98%時孢子囊萌發(fā)率低，且前16 h孢子囊不萌發(fā)，至 24 h孢子囊萌發(fā)率只有2%;相對濕度為100%時孢子囊萌發(fā)率達(dá)到最大，48 h萌發(fā)率達(dá)到14.0%，這表明水分條件是孢子囊萌發(fā)的必要條件。南京及長江中下游地區(qū)3—5月多雨天氣，是霜霉病的高發(fā)期，這可能與100%的相對濕度是霜霉菌萌發(fā)最適相對濕度有關(guān)。

霜霉病是影響不結(jié)球白菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害之一。不結(jié)球白菜霜霉菌為專性寄生菌，菌株不易保存，在一定程度上影響了不結(jié)球白菜霜霉病機(jī)理的研究。從病原物生物學(xué)特性和致病性入手對研究品種抗霜霉病發(fā)病機(jī)理具有重要意義[9]。通過接種方法的優(yōu)化，接種后葉片發(fā)病周期短、重復(fù)性好，調(diào)查快捷、易操作，能快速測定不結(jié)球白菜品種的抗病性和霜霉菌菌株的致病性。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，可將品種分為高抗、抗病、中抗、感抗和高感等5類，其中多為中抗或感病品種。Cc-nj2的侵染能力最強，Cc-nj3的侵染能力最弱，這可能與菌株的使用以及采集的地域差異有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。一般認(rèn)為，接種后葉片出現(xiàn)局部壞死為過敏性壞死反應(yīng)，壞死斑的出現(xiàn)能夠隔離菌絲在葉片內(nèi)部延伸，阻止霜霉病的進(jìn)一步蔓延。

本研究明確了不結(jié)球白菜在不同環(huán)境下的生物學(xué)特性及致病性，以期為該病的發(fā)生與防治提供理論基礎(chǔ)與依據(jù)。雖然本試驗只對10種不結(jié)球白菜霜霉菌菌株進(jìn)行研究，但選擇的菌株代表性較強，且來自不同的地區(qū)和寄主，客觀性較強，對菌株生理小種進(jìn)一步鑒定具有一定的說服力。為進(jìn)一步探究不結(jié)球白菜霜霉菌生理小種生物學(xué)特性和致病性差異，全國各個地區(qū)和不同氣候條件下不結(jié)球白菜霜霉病病株的收集工作必不可少。

4? ? 參考文獻(xiàn)

[1] MONOT C，PAJOT E，CORRE D.Induction of systemic resi-stance in broccoli （Brassica oleracea var. italica） against dow-ny mildew （Peronospora parasitica） by a virulent isolates[J].Biological Control， 2002，24：75-81.

[2] GUNN N D，BEYNON J L，HOLUB E B.Outcrossing of two homothallic isolates of Peronospora parasitica and segregation of avirulence matching six resistance loci in Arabidopsis tha-liana[M].Dordrecht：Springer，2007，34：185-188.

[3] NASHAAT N I，HERAN A，MITCHELL S E.New genes for resistance to downy mildew （Peronospora parasitica） in oil-seed rape （Brassica napus spp. oleifera）[J].Plant Pathology，1998，46：964-968.

[4] SILUE D，NASHAAT N I，TIRILLY Y.Differential responses of Brassica oleracea and B. rapa accessions to seven isolates of Peronospora parasitica at the cotyledon stage[J].Plant Dise-ase，1996，80：142-144.

[5] GRANKE L L，MORRICE J，HAUSBECK M K.Relationships between airborne Pseudoperonospora cubensis sporangia，en-vironmental conditions，and cucumber downy mildew severity[J].Plant Disease，2014，98：674-681.

[6] WANG W，YAN L，MENG R，et al.Sensitivity to fluopicolide of wild type isolates and biological characteristics of fluopi-colide-resistant mutants in Pseudoperonospora cubensis[J].Crop Protection，2014，55：119-126.

[7] 崔鐵軍，劉躍庭，羅加鳳，等.寄生霜霉Peronospora parasi-tica（Pers.） Fr.孢子囊萌發(fā)方式的觀察[J].菌物學(xué)報，2008，27（5）：775-777.

[8] 趙雪艷，張瑋，嚴(yán)紅，等.不同葡萄品種對霜霉病的田間苗期抗性評價[J].植物保護(hù)，2014，40（5）：172-175.

[9] 李明遠(yuǎn).十字花科蔬菜霜霉病的發(fā)生與防治[J].當(dāng)代蔬菜，2004（8）：38-39.

作者簡介? ?文鍇（1990—），男，河北邢臺人，碩士，研究實習(xí)員。研究方向：蔬菜育種。

收稿日期? ?2020-07-01