徐冰 史秀羽 陳宇

[摘要] 目的 了解杭州地區(qū)地中海貧血的檢出情況，探討產(chǎn)檢中篩查地中海貧血的意義，評價平均紅細胞體積（MCV）、平均血紅蛋白量（MCH）及血紅蛋白電泳對地中海貧血進行產(chǎn)前篩查的價值。 方法 以2019年2月～2020年3月在我院檢查的3968例育齡期婦女為研究對象，進行血常規(guī)、血紅蛋白電泳及β-地貧基因檢測。 結(jié)果 篩查3968例育齡期婦女，疑似α-地中海貧血或缺鐵性貧血共有366例（9.22%），其中妊娠中晚期孕婦有255例;疑似β-地中海貧血共有19例（0.48%），其中有4例進行β-地貧基因檢測，均被確診為β-地中海貧血，分別為βIVS-II-654/βN突變1例，βCD17/βN突變2例，βCD41/42/βN 1例。 結(jié)論 MCV、MCH及血紅蛋白電泳可以對地中海貧血進行產(chǎn)前篩查，整體操作較為簡便。加強地中海貧血篩查及檢測，可以降低出生缺陷，對優(yōu)生優(yōu)育具有重要意義。

[關(guān)鍵詞] 毛細血管電泳儀;地中海貧血;基因診斷;產(chǎn)前篩查

[中圖分類號] R556.61? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）28-0143-04

Application of automatic capillary electrophoresis in screening for thalassemia in Hangzhou area

XU Bing? ?SHI Xiuyu? ?CHEN Yu

Department of Laboratory， Hangzhou Obstetrics and Gynecology Hospital， Hangzhou? ?310008， China

[Abstract] Objective To understand the detection situation of thalassemia in Hangzhou area，to explore the significance of screening for thalassemia during obstetric testing， and to evaluate the value of mean red blood cell volume（MCV）， mean hemoglobin volume（MCH） and hemoglobin electrophoresis for prenatal screening of thalassemia. Methods A total of 3968 women of childbearing age examined in our hospital from February 2019 to March 2020 were taken as the research subjects. They underwent blood routine， hemoglobin electrophoresis and β-thalassaemia genes detection. Results A total of 3968 cases of women of childbearing age were screened. A total of 366 cases（9.22%） were suspected of α-thalassemia or iron deficiency anemia， including 255 pregnant women in mid-to-late pregnancy. Nineteen cases（0.48%） were suspected of β-thalassemia，of which 4 cases were tested for β-thalassemia gene. All were diagnosed with β-thalassemia， with 1 case of βIVS-II-654/βN mutation， 2 cases of βCD17/βN mutation， 1 case of βCD41/42/βN， respectively. Conclusion The MCV， MCH and hemoglobin electrophoresis can be used for prenatal screening of thalassemia， and the overall operation is relatively simple. Strengthening the screening and detection of thalassemia can reduce birth defects and is of great significance for eugenics.

[Key words] Capillary electrophoresis instrument; Thalassemia; Genetic diagnosis; Prenatal screening

地中海貧血（Thalassemia）又稱珠蛋白生成障礙性貧血或海洋性貧血，是一組由于基因缺陷導致生成血紅蛋白的珠蛋白肽鏈（αβγδ）的結(jié)構(gòu)異常或合成異常所致的遺傳性溶血性貧血疾病，屬常染色體隱性遺傳病[1]。根據(jù)合成障礙的肽鏈不同可分為α型、β型、δβ型和δ型4種，其中以α-地中海貧血和β-地中海貧血（簡稱α-地貧和β-地貧）最為常見。世界上有 4.83%的人口攜帶珠蛋白變異基因[2]，主要集中在熱帶和亞熱帶地區(qū)，好發(fā)于地中海沿岸、美國黑人人群、北非、東南亞和印度次大陸等地區(qū)。我國則集中在南方地區(qū)，以廣東、廣西、海南和香港最多見[3]，北方則少見。其中2012年廣東育齡人群的地中海貧血基因攜帶率約為16.83%[4]，廣西人群中地中海貧血基因攜帶率為12.22%～23.02%[5-7]，是我國南方重點防治的單基因遺傳性疾病。目前尚無根治方法，最根本的措施是進行產(chǎn)前常規(guī)篩查和診斷，在育齡人群中進行地貧常規(guī)篩查，對篩查陽性者進行基因檢測后再進行遺傳咨詢。本研究對2019年2月～2020年3月在我院進行常規(guī)檢查的3968例育齡期婦女為研究對象，應(yīng)用血常規(guī)和血紅蛋白電泳技術(shù)對地中海貧血進行篩查，然后再應(yīng)用基因檢測技術(shù)進行驗證，以了解杭州地區(qū)地中海貧血的檢出情況，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年2月～2020年3月在我院進行常規(guī)檢查的3968例育齡期婦女，年齡15～49歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理? 研究對象無需空腹，采集靜脈血4 mL分兩次每次2 mL注入一次性含乙二胺四乙酸二鉀（EDTK-K2）抗凝劑的真空采血管中，一管用于血常規(guī)檢測，另一管用于血紅蛋白電泳檢測。血常規(guī)當天檢測，用于血紅蛋白電泳檢測的樣本可置于2～8℃冰箱保存，7 d內(nèi)檢測。

1.2.2 血常規(guī)相關(guān)指標檢測? 應(yīng)用邁瑞B(yǎng)C-6900全自動血細胞分析儀（BC-6900血球儀）及配套試劑進行血常規(guī)五分類檢測，得出MCV及MCH值。BC-6900血球儀采用鞘流阻抗法、激光散射法、結(jié)合熒光染色的流式細胞技術(shù)進行細胞分類、計數(shù);采用比色法進行血紅蛋白測定。

1.2.3 血紅蛋白電泳檢測? Capillarys 2 Flex Piercing是全自動電腦控制通過電泳和數(shù)據(jù)處理進行蛋白質(zhì)分離的、多項目的毛細管電泳系統(tǒng)。本實驗應(yīng)用法國Sebia公司生產(chǎn)的Capillarys 2全自動毛細血管電泳儀進行血紅蛋白電泳檢測，使用前核對儀器性能及準備配套試劑盒，按照說明書進行操作，標本無需洗滌和溶血，直接將抗凝標本放入儀器試管架中，一個檢測架可同時檢測8個樣本，可同時檢測多批樣本，將試管架推入電泳儀進行檢測，查看結(jié)果。

1.2.4地貧基因診斷? 對于篩查表型陽性標本應(yīng)用DNA快速提取試劑盒按操作說明提取其DNA。采用PCR結(jié)合反向點雜交 RDB（PCR-RDB）方法，檢測中國人中常見的17種β-地貧基因突變：CD41/42、CD71/72、CD27/28、CD14/15、CD26、CD31、CD17、CD34、Int、IVS-1-1、IVS-1-5、-32、-30、-29、-28、CAP、IVS-2-654。試劑盒購于深圳亞能生物公司，按試劑盒說明書進行操作、質(zhì)量控制及結(jié)果判斷。取 DNA 2 μL加入反應(yīng)管中，PCR 條件：50℃ 15 min，95℃ 10 min，然后94℃ 60 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s經(jīng)35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。將擴增產(chǎn)物與結(jié)合有中國人較常見的17種β-地貧基因突變寡核苷酸探針的膜條進行反向點雜交，鑒定β-地貧基因突變的類型。

1.3 診斷標準

血常規(guī)MCV≤80 fL，MCH≤27 pg[8-9]，HbA2<2.2提示可能是α-地中海貧血或是缺鐵性貧血;如果HbA2>3.2 提示可能是β-地中海貧血[10]。

2 結(jié)果

篩查3968例育齡期婦女結(jié)果顯示，HbA2<2.2共有366例，檢出率為9.22%，其中有255例為妊娠中晚期孕婦;HbA2>3.2 共有27例，檢出率為0.68%，其中血常規(guī)結(jié)果符合MCV≤80 fL，MCH≤27 pg有19例（0.48%），其中有4例進行β-地貧基因檢測，均被確診為β-地中海貧血，分別為βIVS-Ⅱ-654/βN突變1例，βCD17/βN突變2例，βCD41/42/βN 1例。

3 討論

地中海貧血是一種家族遺傳性溶血性貧血病，由于基因缺陷，血紅蛋白中一種或多種珠蛋白鏈合成缺如或不足，使紅細胞體積較小或壽命縮短，導致疾病的發(fā)生，是世界上最常見和發(fā)病率最高的遺傳性溶血性貧血，也是危害最嚴重的血紅蛋白病之一[11]。其中β-地中海貧血的分子基礎(chǔ)主要為少數(shù)核苷酸的缺失、插入或置換，目前全世界發(fā)現(xiàn)的β-地貧基因突變已超過200種，中國人β-地貧基因突變類型34種，但不同地區(qū)的人群有各自的常見基因突變類型[12]。通常，如果父母雙方只要其中一人是地貧輕度患者，或是攜帶地貧基因，那么就會將該基因遺傳到下一代，如果父母雙方均攜帶該基因，那么患兒就會擁有2個致病基因。輕型地貧患兒在剛出生時，不會出現(xiàn)明顯的異常，與其他嬰兒無異，但是隨著時間的推移，患兒就會出現(xiàn)渾身無力、貧血、全身浮腫等現(xiàn)象。而重型地貧患兒出生后不久就會夭折，有的甚至是胎死腹中。

地中海貧血常見的兩個類型為α-地中海貧血與β-地中海貧血。α-地中海貧血在臨床上可分為4種類型：靜止型、標準型、Hb H病和Hb Bart's胎兒水腫綜合征，其分子機制分別有1、2、3、4個α-基因缺陷（缺失或突變）。靜止型無任何特殊癥狀，與正常嬰兒無異，紅細胞無異常，臍血可能會與正常指標有所差距，但是一般在3個月后便可恢復正常;輕型與靜止型相同，無特殊癥狀，血中紅細胞形態(tài)輕度異常，臍血也很難達到正常指標，但多在半年后便可自行消失，對患兒基本沒有傷害;Hb H病患者有輕至中度貧血，出現(xiàn)肝脾腫大、黃疸等癥狀;Hb Bart's水腫胎常于妊娠晚期（23～38周）胎死腹中或早產(chǎn)后數(shù)小時死亡，這類胎兒較為明顯的體形特征是腹部和胸部出現(xiàn)積水伴有重度貧血。另外，一些非缺失型Hb H病和非缺失型 α-地貧純合子患兒會出現(xiàn)嚴重貧血，有的甚至需要輸血治療。

在β-地中海貧血中，輕型β-地中海貧血無任何特殊癥狀，脾臟大小正常，如果日后沒有特殊病情出現(xiàn)，壽命不受影響，可一直正常生活到老年;中間型β-地中海貧血癥狀較輕型重，較重型輕，常在幼兒時期出現(xiàn)貧血癥狀，骨骼有輕微改變，脾臟略大，多于幼童期出現(xiàn)中度貧血癥狀;重型β-地中海貧血患兒出生時無殊，出生數(shù)日后逐漸出現(xiàn)異常，如肝脾腫大進行性加重、發(fā)育不良、黃疸伴嚴重貧血等癥狀，隨著年齡的增長，患兒會出現(xiàn)特殊表現(xiàn)，如頭大、眼距增寬、馬鞍鼻、前額突出、兩頰突出，其典型的表現(xiàn)是臀狀頭、長骨可骨折等，骨骼改變是骨髓造血功能亢進、骨髓腔變寬、皮質(zhì)變薄所致，少數(shù)患者在肋骨及脊椎之間發(fā)生胸腔腫塊，亦可見膽石癥、下肢潰瘍，除了外觀上的異常，患兒身體的器官也同樣會出現(xiàn)不適，如肺炎、氣管炎等，最為嚴重的是引發(fā)心臟疾病，極易造成心臟衰竭，如果不配合相關(guān)治療，患兒往往活不過5歲。由于輕型β-地中海貧血可無臨床癥狀，所以極易造成漏診和誤診。

目前國內(nèi)外用于明確診斷的是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)結(jié)合其他分子生物學手段檢測β-地中海貧血基因[13]，但分子生物學技術(shù)要求條件高，方法繁瑣，尚不能廣泛應(yīng)用于各級醫(yī)院特別是基層醫(yī)院。因此，常用簡單、方便的血液檢測方法進行地中海貧血的篩查，包括平均紅細胞參數(shù)（MCV、MCH、MCHC）、紅細胞脆性、血紅蛋白電泳等[14]，其中血紅蛋白電泳在地中海貧血的篩查中起到非常重要的作用。正常人體內(nèi)有3種血紅蛋白即HbA、HbA2、HbF，應(yīng)用血紅蛋白電泳目的是檢出和確認各種正常和異常的血紅蛋白，因各種Hb的等電點不同，所帶電荷量不同，可將其分成不同的區(qū)帶。全自動血紅蛋白電泳能夠定量檢測HbA、HbA2、HbF的含量，根據(jù)Hb各組份含量計算。其中HbA2可用于地中海貧血篩查[15]，主要用于地中海貧血的分型，HbA2降低是由于α鏈合成缺失或減少，而HbA2增高，則說明β鏈合成出現(xiàn)問題，一般為β-地中海貧血[16]。HbA2的分離可通過高壓液相離子交換層析法（IE-HPLC）或電泳法，應(yīng)用Capillarys 2全自動毛細血管電泳儀檢測時，不但可完全分離部分血紅蛋白變異體，相對于IE-HPLC操作簡單，自動化程度高，檢測時間短，無需切換模式和更換試劑[17]。同時，有文獻也證實Capillarys 2全自動毛細血管電泳儀檢測的HbA2適用于β-地中海貧血的篩查，其敏感性和特異性更高[18]。

MCV是地中海貧血篩查中較為重要的指標，MCV及MCH假陽性主要以小細胞低色素貧血常見，且致病原因多，常見的因缺血引起的貧血中既有表現(xiàn)為MCH、MCV降低的類型，初篩判斷為地貧患者中有相當一部分患者屬于缺鐵性貧血，本研究對象為3968例育齡期婦女，HbA2<2.2共有366例，檢出率為9.22%，其中有255例為妊娠中晚期孕婦，經(jīng)過流行病學調(diào)查，中國約20%的孕婦有生理性的缺鐵性貧血發(fā)生，多數(shù)在補充鐵劑后，就會得到糾正，產(chǎn)后也會逐漸恢復。所以，初篩HbA2<2.2時需經(jīng)過血清鐵蛋白檢測排除，以降低地中海貧血假陽性率[19]，排除缺鐵性貧血后，再進行基因檢測診斷地中海貧血。HbA2>3.2共有27例，檢出率為0.68%，其中血常規(guī)結(jié)果符合MCV≤80 fL，MCH≤27 pg的有19例（0.48%），其中有4例進行β-地貧基因檢測，均被確診為β-地中海貧血，分別為βIVS-Ⅱ-654/βN突變1例，βCD17/βN突變2例，βCD41/42/βN 1例。由此可以得出結(jié)論，相對于廣西和廣東省等地貧高發(fā)地區(qū)，杭州屬于低發(fā)區(qū)。但隨著我國經(jīng)濟水平的提高，交通的發(fā)達與便利，人口流動性不斷增加，低發(fā)病區(qū)的發(fā)病率也會逐漸提高，所以，重視并建立有效的地中海貧血產(chǎn)前篩查與診斷模式尤為重要。

地中海貧血有多種篩查方法，血液學指標MCV、MCH對地貧篩查敏感性較高，可自動化、大批量操作，適合用于大規(guī)模健康人群的地貧篩查。血紅蛋白電泳分析是診斷和分離異常血紅蛋白的有效方法，對于初篩陽性者通過血紅蛋白電泳區(qū)分出不同的地中海貧血類型，需要對其進行一對一的遺傳咨詢和優(yōu)生指導，特別是對高危夫婦通過進一步的基因診斷和產(chǎn)前診斷。目前PCR技術(shù)仍是臨床上地貧基因突變確認的最佳手段[20]，基因診斷技術(shù)能確診地中海貧血缺失或突變[21]，有效提高地中海貧血的檢出率，對優(yōu)生優(yōu)育、干預重癥地中海貧血患兒出生有著重要作用[22]，可以有效預防重癥地中海貧血患兒的出生。隨著科技的發(fā)展，各種檢測手段層出不窮，但總的目標是更方便、更快捷、更便宜，為提高地中海貧血診斷的準確性，減少誤診和漏診，將篩查法和基因診斷法有機結(jié)合起來，并為產(chǎn)前診斷、產(chǎn)前預防、選擇性流產(chǎn)等方面做出應(yīng)有的貢獻。

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（收稿日期：2020-03-31）