鐘文權(quán)，鄭聯(lián)合，鄒 易，李豫強(qiáng)，張 威，戴 煌，肖安紅

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023; 2.湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023; 3.海南省糧油科學(xué)研究所，海口 571400)

瓊崖海棠(CalophylluminophyllumL.)，又名海棠果、紅厚殼、胡桐、海桐、君子樹(shù)、海棠木，為藤黃科 (Guttiferae) 紅厚殼屬(Calophyllumgenus) 常綠喬木，喜高溫、耐旱熱、防海潮、抗強(qiáng)風(fēng)，在熱帶沿海作為防風(fēng)林和護(hù)堤林被廣泛種植，目前在我國(guó)廣東、廣西、臺(tái)灣及東南亞、非洲等熱帶地區(qū)均有分布[1]。瓊崖海棠籽富含油脂，種仁干基粗脂肪含量為 50%～60%[2]。瓊崖海棠籽油的主要脂肪酸為9-十八碳烯酸(27. 67%)、9, 12-十八碳二烯酸(16.78%)、9-十八碳烯酸(E)(13. 54%)、十八碳酸(12.92%)、十六碳酸(10.77%)、11, 14-二十碳二烯酸(7.17%)、正十六碳酸(5.24%)、十七碳酸(5.13%)[3]。在海南，瓊崖海棠籽油常被民間用作防腐劑、抗菌劑、收斂藥、止疼劑等，用于治療跌打損傷、外傷出血，減緩關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛等疾病[4-5]。由于瓊崖海棠籽中含有具有一定毒性的酚類、香豆素類、黃酮類、三萜類[6]和生物堿[7]等物質(zhì)，在制油時(shí)，這些物質(zhì)會(huì)轉(zhuǎn)移至油中，并使油脂呈深綠色、渾濁、味苦并具有類似中草藥特殊氣味，所以瓊崖海棠籽未作為新食用油料資源進(jìn)行研發(fā)。

為開(kāi)發(fā)瓊崖海棠籽作為新的食用油料資源，前期本實(shí)驗(yàn)室對(duì)瓊崖海棠籽毛油和精煉油進(jìn)行了小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，其中瓊崖海棠籽毛油急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)采用寇氏法[8]，精煉油采用限量法[8]。結(jié)果顯示：瓊崖海棠籽毛油對(duì)雄性小鼠的LD50為 9 217.6 mg/kg，LD50的95%可信限為8 606.4～9 871.3 mg/kg，雌性小鼠的LD50為9 066.4 mg/kg，LD50的95%可信限為8 546.9～9 617.5 mg/kg[9]；瓊崖海棠籽精煉油的LD50大于15 000 mg/kg。從而判定瓊崖海棠籽毛油毒性級(jí)別為實(shí)際無(wú)毒級(jí)，精煉油毒性級(jí)別為無(wú)毒[8]。在此基礎(chǔ)上，本文采用體內(nèi)與體外試驗(yàn)、體細(xì)胞試驗(yàn)與生殖細(xì)胞試驗(yàn)相結(jié)合的原則，從不同的遺傳學(xué)終點(diǎn)和靶向的角度，即Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)對(duì)瓊崖海棠籽毛油的遺傳毒性進(jìn)行了全面評(píng)價(jià)，以期為海棠籽開(kāi)發(fā)作為新食用油料資源積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

瓊崖海棠籽毛油，實(shí)驗(yàn)室自制，主要理化指標(biāo)和油脂伴隨物含量分別見(jiàn)表1和表2。

試驗(yàn)用昆明種小鼠，清潔級(jí)，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2019-0010，使用許可證號(hào)為SYXK(鄂)2016-0057。

Gimesa染液、小牛血清，江蘇南京建成生物工程研究所；玉米油，中糧福臨門(mén)食品有限公司；無(wú)水乙醇、環(huán)磷酰胺、甲醇、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

E3CMOS06300KPA生物顯微鏡，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司。

表1 瓊崖海棠籽毛油主要理化指標(biāo)

表2 瓊崖海棠籽毛油油脂伴隨物含量

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)[10]

選用昆明種健康成年小鼠，體重22～25 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。根據(jù)急性毒理試驗(yàn)結(jié)果，按1/8 LD50、1/4 LD50和1/2 LD50分為3個(gè)劑量組，雌性分別為1 133.3、2 266.6、4 533.2 mg/kg，雄性分別為1 152.2、2 304.4、4 608.8 mg/kg，以玉米油為陰性對(duì)照組(劑量為1/8 LD50)，以環(huán)磷酰胺水溶液為陽(yáng)性對(duì)照組(劑量為40 mg/kg)，隨機(jī)分組，每組10只，每組雌雄各半。0、24 h經(jīng)口2次灌胃，30 h時(shí)頸椎脫臼處死小鼠，四肢固定于解剖板，將腹中線被毛浸濕，剖開(kāi)胸腹部，取下胸骨，擦凈血污，剔去肌肉，剪去骨骺，用小型彎止血鉗將骨髓擠于有一滴小牛血清的清潔載玻片上，混合均勻后推片，自然晾干。按以下操作步驟制片：①浸入99.5%甲醇溶液缸中固定15 min，取出自然晾干；②將固定后的玻片浸入Gimesa染液缸中染色15 min，然后立即用pH為6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗掉玻片上的染色液，自然晾干，陰涼干燥處保存?zhèn)錂z。

將制好的骨髓片先在低倍顯微鏡下觀察，選擇細(xì)胞完整、分布均勻、染色較好的區(qū)域作為檢測(cè)區(qū)域；然后用油鏡閱片，觀察骨髓嗜多染紅細(xì)胞、正多染紅細(xì)胞、含微核細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

每只小鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)骨髓嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocyte，PCE)，觀察含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，并計(jì)數(shù)微核數(shù)，計(jì)算微核細(xì)胞率(微核細(xì)胞率=含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)/嗜多染紅細(xì)胞總數(shù)×100%)，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞中骨髓嗜多染紅細(xì)胞與正多染紅細(xì)胞(normochromatic erythrocyte，NCE)的比值，結(jié)果采用U檢驗(yàn)法檢驗(yàn)結(jié)果的差異性。

飼養(yǎng)條件：試驗(yàn)小鼠在19～25℃、相對(duì)濕度50%、光照強(qiáng)度130～325 lx、氨質(zhì)量濃度小于等于20 mg/L、噪聲小于等于50 dB環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，每天上午9點(diǎn)更換飼料、墊料和水并正常飼養(yǎng)，自由采食、飲水。

1.2.2 小鼠精子畸形試驗(yàn)[11]

選用昆明種健康成年雄性小鼠，體重20～35 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，劑量分組、飼養(yǎng)條件均同1.2.1。連續(xù)5 d上午9點(diǎn)灌胃，第35天脫臼處死小鼠，取出睪丸附近二側(cè)的附睪器官，放進(jìn)裝有2 mL左右生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)的平皿里，用眼科剪將洗凈的附睪縱向剪1～2刀，靜置3～5 min，輕輕搖動(dòng)，用四層擦鏡紙將剪碎的附睪溶液進(jìn)行過(guò)濾，吸濾液進(jìn)行涂片，在空氣中自然干燥后，浸入1%伊紅染液缸中染色1 h，再浸入99.5%甲醇溶解缸中5 min左右，取出自然晾干，1 h后用蒸餾水輕輕地沖掉染液，自然晾干，陰涼干燥處保存?zhèn)錂z。

首先在低倍顯微鏡下找到背景比較清晰而且精子重疊比較少的區(qū)域?yàn)槭軝z區(qū)域，然后再用高倍顯微鏡按從左到右和從上到下的順序逐個(gè)檢查并記錄精子的形態(tài)，其中無(wú)鉤、香蕉形、胖頭、無(wú)定形、尾折疊、雙頭等為畸形精子。每只試驗(yàn)動(dòng)物以1 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子為基數(shù)，計(jì)數(shù)精子畸形數(shù)，計(jì)算精子畸形率，并采用Wilcoson秩和檢驗(yàn)法檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

1.2.3 Ames試驗(yàn)[12]

依照GB 15193.4—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)》中平板摻入法進(jìn)行。試驗(yàn)分瓊崖海棠籽毛油組、溶劑對(duì)照組(二甲基亞砜)、陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組(不添加受試物)，陽(yáng)性誘變劑采用敵克松(TA97、TA98, 不加S9)、甲基磺酸甲酯(TA100、TA102, 不加S9)、2-氨基芴(TA97、TA98、TA100, 加S9) 及1,8-二羥基蒽醌(TA102, 加S9)。

選用鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102，經(jīng)鑒定合格后開(kāi)展試驗(yàn)。活化系統(tǒng)為多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝S9, 蛋白質(zhì)含量為37.5 mg/mL, 其對(duì)2-氨基芴具良好代謝激活能力，每100 mL S9混合液中加入10 mL S9。

由于受試物對(duì)菌株無(wú)細(xì)菌毒性，設(shè)置受試物的最高劑量為5 μL/皿(約4 647 μg/皿)，在加與不加S9混合液的情況下，分兩次試驗(yàn)，第一次以5.0、2.5、1.3、0.6 μL/皿及0.3 μL/皿劑量進(jìn)行試驗(yàn)，第二次以5.0、1.0、0.2、0.04 μL/皿及0.008 μL/皿劑量進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)平行。受試樣品的稱量和配制均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，受試樣品用二甲基亞砜溶解配制成50 μL/mL高劑量組，以下8個(gè)劑量組分別用二甲基亞砜逐級(jí)稀釋，加樣量均為0.1 mL/皿。在2 mL頂層培養(yǎng)基中加入0.1 mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1 mL 受試樣品溶液和0.5 mL S9混合液(當(dāng)需要活化時(shí))?；靹蚝笱杆賰A注在底層培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)，當(dāng)受試物菌落回變數(shù)超過(guò)自發(fā)回變數(shù)的2倍以上并有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)判定為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表3)

表3 小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，雌性和雄性小鼠陰性對(duì)照組微核細(xì)胞率分別為0.26%和0.24%，小于0.5%[10]，陽(yáng)性對(duì)照組的微核細(xì)胞率相對(duì)陰性對(duì)照組存在極顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明陰性對(duì)照組可選擇玉米油進(jìn)行試驗(yàn)。瓊崖海棠籽毛油低、中、高劑量組均會(huì)引起小鼠發(fā)生微核突變，低劑量組相對(duì)陰性對(duì)照組均不存在顯著性差異；中、高劑量組相對(duì)陰性對(duì)照組存在極顯著差異(P<0.01)，且隨著劑量的增加，微核細(xì)胞率呈逐漸上升的趨勢(shì)，有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系[10]，結(jié)果顯示陽(yáng)性。

2.2 小鼠精子畸形試驗(yàn)(見(jiàn)表4)

由表4可見(jiàn)，陰性對(duì)照組的精子畸形率為2.19%，在0.8%～3.4%[11]范圍內(nèi)，中、高劑量組相對(duì)陰性對(duì)照組存在極顯著差異(P<0.01)，且隨著劑量的增加，精子畸形率呈逐漸上升的趨勢(shì)，有劑量-反應(yīng)關(guān)系[11]，為陽(yáng)性結(jié)果。

表4 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

2.3 Ames試驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表5、表6)

瓊崖海棠籽毛油兩次細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，平板上菌株生長(zhǎng)良好，未觀察到污染菌落。由表5和表6可知：空白對(duì)照組的試驗(yàn)結(jié)果表明4種菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)與GB 15193.4—2014和文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道一致，結(jié)合菌株鑒定結(jié)果，表明菌株?duì)顟B(tài)正常；陽(yáng)性對(duì)照組的回變菌落數(shù)顯著高于自發(fā)突變，表明陽(yáng)性誘變劑有效。將不同劑量的受試物樣品組與溶劑對(duì)照組的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在添加與不添加S9混合物情況下，兩次試驗(yàn)中所有劑量的受試物樣品組的回變菌落數(shù)均未超過(guò)溶劑對(duì)照組回變菌落數(shù)的2倍，且無(wú)劑量-反應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明受試物瓊崖海棠籽毛油對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100及TA102 4株試驗(yàn)菌株，在添加與不添加S9混合物情況下，均未觀察到致基因突變作用。

表5 Ames試驗(yàn)結(jié)果(第一次)

表6 Ames試驗(yàn)結(jié)果(第二次)

2.4 討論

遺傳終點(diǎn)具有多樣化特性，本研究采用Ames試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)和小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)組合檢測(cè)多個(gè)遺傳終點(diǎn)。Ames試驗(yàn)是檢測(cè)基因突變的體外試驗(yàn)，利用鼠傷寒沙門(mén)氏菌的突變營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株為指示物，檢測(cè)DNA堿基序列是否改變。小鼠精子畸形試驗(yàn)檢測(cè)受試物對(duì)精子不同發(fā)育階段的影響，評(píng)價(jià)生殖細(xì)胞的受損情況。小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多染色體及X、Y性染色體基因直接或間接地決定精子形態(tài)。精子畸形主要是指形態(tài)的異常，已知精子的畸形是決定精子形成的基因發(fā)生突變的結(jié)果。因此，形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的改變，說(shuō)明環(huán)境因子對(duì)精子生成、發(fā)育有影響。小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)是檢測(cè)染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法。無(wú)著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)成為微核。有很多化學(xué)物質(zhì)能引起染色體的異常。染色體是遺傳物質(zhì)的載體并含有生物體全部的遺傳信息，染色體遺傳信息的異?？刹煌潭鹊赜绊懮餀C(jī)體的生存，輕者突變，重者死亡。染色體僅出現(xiàn)微小的異常變化，都可能對(duì)人體健康產(chǎn)生非常嚴(yán)重的影響。

本實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示瓊崖海棠籽毛油屬于實(shí)際無(wú)毒，精煉油屬于無(wú)毒。在遺傳毒性試驗(yàn)中，瓊崖海棠籽毛油各劑量組在Ames試驗(yàn)(鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA97、TA98、TA100、TA102)中結(jié)果均為陰性，表明瓊崖海棠籽毛油在體外試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)致突變作用。在小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)中，與陰性對(duì)照組相比，瓊崖海棠籽毛油中、高劑量組微核細(xì)胞率存在極顯著差異(P<0.01)，有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，為陽(yáng)性結(jié)果，引起染色體異常。在小鼠精子畸形試驗(yàn)中，相對(duì)陰性對(duì)照組，瓊崖海棠籽毛油中、高劑量組精子畸形率存在極顯著差異(P<0.01)，有劑量-反應(yīng)關(guān)系，結(jié)果也為陽(yáng)性，對(duì)決定精子形成的基因發(fā)生了突變。

目前，對(duì)于瓊崖海棠籽毛油中存在的化學(xué)成分未完全分析鑒定清楚，根據(jù)目前國(guó)外學(xué)者對(duì)紅厚殼屬植物的葉、莖、根、皮、種子等部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析研究結(jié)果推斷，瓊崖海棠籽毛油中可能有呫噸酮類、香豆素類、黃酮類、萜類[7]、酚類、生物堿類等多種化合物存在。其中呫噸酮類包括Calozeylo-xanthone、1,5-Dihydroxyxanthone、6-Deoxyjacareubin和Caledonixanthone等[6]，香豆素類包括Inophyllum A、B、C、D和Calophyllolide等[6]，黃酮類包括Amentoflavone、Biflavanone和Pyranoamentoflavone等[6]，萜類包括Canophyllal、Canophyllol和Taraxerone等[6]。本研究測(cè)定了瓊崖海棠籽毛油中黃酮、三萜、總酚、香豆素和生物堿含量(見(jiàn)表2)，這些成分有些具有一定的毒性。Oodyke[15]研究結(jié)果顯示，香豆素類對(duì)大鼠口服LD50為293 mg/kg，按照我國(guó)化合物經(jīng)口急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[16]中的毒性分級(jí)判定可知，香豆素為中等毒性。香豆素類化合物在高劑量時(shí)具有遺傳毒性和肝臟毒性等[17]。由此可以推斷，瓊崖海棠籽毛油的小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)為陽(yáng)性，可能與其含有呫噸酮類、香豆素類、萜類和生物堿類等化學(xué)物質(zhì)有關(guān)。

物質(zhì)的毒性不僅與物質(zhì)的本身性質(zhì)有關(guān)，也與攝入該物質(zhì)的劑量有關(guān)。若按照體重50 kg的成年人每人每天油脂的攝入量25～30 g[18]計(jì)算，則瓊崖海棠籽毛油或精煉油的攝入劑量為500～600 mg/kg，低于瓊崖海棠籽毛油小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)陰性結(jié)果的低劑量1 133.2 mg/kg(雌性)和1 152.2 mg/kg(雄性)。由此，可推斷對(duì)于瓊崖海棠籽毛油在推薦攝入劑量(500 ～ 600 mg/kg)時(shí)對(duì)受試物不具遺傳毒性。

3 結(jié) 論

瓊崖海棠籽毛油的小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)和精子畸形試驗(yàn)的中、高劑量組為陽(yáng)性結(jié)果；Ames試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。瓊崖海棠籽毛油中所含呫噸酮類、香豆素類、萜類和生物堿等化學(xué)物質(zhì)可能是遺傳毒性為陽(yáng)性的原因。小鼠骨髓紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)為陰性結(jié)果的低劑量，高于推薦油脂攝入量，說(shuō)明在推薦油脂攝入量下，瓊崖海棠籽毛油對(duì)受試物不具遺傳毒性。