鄭富良，楊 斌，黃濟勇，楊 博，曾哲靈，余 平

(1.南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院，南昌330031； 2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌330047)

樟樹籽仁油(CCSKO)是從樟樹的籽中提取所得。CCSKO中中碳鏈甘油三酯(Medium-chain tricylglycerols, MCT)含量達(dá)95%以上。CCSKO為迄今發(fā)現(xiàn)的唯一天然MCT，食用安全，具有減少體內(nèi)脂肪沉積和肝臟脂變[1-2]、降低血脂和血糖作用[3-4]。MCT易于被水解、吸收、氧化釋放能量，是一種快速能量的來源[5-6]， 可用于吸收不良綜合征人群的飲食治療[7]。但是，Jeukendrup等[8]研究表明攝入過量的MCT會引起副作用。從脂肪酸組成分析，CCSKO含辛酸0.3%～2.6%、癸酸51%～62%、月桂酸34%～40%，不含必需脂肪酸，不能完全滿足日常的營養(yǎng)要求。二十碳五烯酸(EPA)與二十二碳六烯酸(DHA)同屬ω-3長碳鏈多不飽和脂肪酸，主要來源是深海魚[9]。EPA/DHA具有抑制血小板凝結(jié)、抗血栓、調(diào)節(jié)血脂、改善糖尿病以及炎癥等功效[10-11]。

結(jié)構(gòu)脂質(zhì)(SL)是由天然油脂通過改性或結(jié)構(gòu)重組制得，中長碳鏈結(jié)構(gòu)脂質(zhì)是一種新型的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，其結(jié)構(gòu)中同一甘油三酯(TAG)中含有中碳鏈脂肪酸(MCFA)和長碳鏈脂肪酸(LCFA)，同時具備兩種脂肪酸的營養(yǎng)特征。為提高CCSKO的營養(yǎng)價值，可以采用中長碳鏈不飽和脂肪酸油脂對CCSKO進(jìn)行改性制備成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的制備分為化學(xué)法改性和酶法改性。與化學(xué)法改性相比，采用酶法改性反應(yīng)條件更溫和，底物選擇性更高，催化效率更高，副產(chǎn)品更少，更安全[12-13]。國內(nèi)外都有使用酶法合成EPA/DHA結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的報道。楊春芳等[14]使用脂肪酶催化金槍魚油酸解合成含有中長碳鏈的結(jié)構(gòu)脂質(zhì), EPA/DHA摻入總量為27.64%。Willett等[15]使用Novozyme 435脂肪酶催化魚油和癸酸合成含有EPA/DHA的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，EPA/DHA摻入總量達(dá)到34.83%。

因此，本研究擬通過脂肪酶催化酯交換將EPA/DHA交換到CCSKO骨架上制備一種新的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，通過單因素試驗獲得酯交換反應(yīng)制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的最適條件，使其最大限度地發(fā)揮油脂中多不飽和脂肪酸的生理功能和營養(yǎng)價值，并對純化產(chǎn)品的脂肪酸組成及分布、甘油酯組成、理化性質(zhì)和體外抗氧化活性進(jìn)行分析，為 CCSKO的高值化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

樟樹籽仁油(CCSKO)，樟樹籽經(jīng)壓榨、堿煉、過濾得到。魚油乙酯，購自西安偉振生物科技有限公司。

硅膠薄層色譜板(100 mm×200 mm;0.20～0.25 mm)，青島海洋化工有限公司；固定化脂肪酶Novozyme 435 (10 000 PLU/g)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；40種脂肪酸甲酯(FAME)標(biāo)準(zhǔn)混合物，上?；菡\生物有限公司；胰脂肪酶、DPPH自由基試劑、ABTS自由基試劑，上海阿拉丁生化科技有限公司。所有試劑均為分析純或色譜級。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BS223S電子天平，德國賽多利斯有限公司；THZ-92C恒溫油浴鍋；SK1200B超聲儀；KL-UP-III-10超純水制備機；SY-IIID氮吹儀；YOKO-ZX紫外線分析暗箱；7890B氣相色譜儀(GC-FID)、1260高效液相色譜儀(HPLC-ELSD)，美國安捷倫科技有限公司；5600高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-Q-TOF-MS)，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；KDL5短程分子蒸餾儀，德國UIC公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 酯交換制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)

將不同底物摩爾比的CCSKO和魚油乙酯與Novozyme 435脂肪酶在500 mL的燒瓶中混合。將燒瓶放置恒溫油浴鍋中，氮氣保護(hù)下，攪拌反應(yīng)一定時間后，過濾除去脂肪酶得到酯交換粗產(chǎn)物，置于-20℃保存，待進(jìn)一步分析?；厥盏闹久附?jīng)石油醚洗滌，揮發(fā)去溶劑后低溫保存，用于測定脂肪酶的操作穩(wěn)定性。

1.2.2 酯交換放大試驗及產(chǎn)物純化

采用最佳反應(yīng)條件進(jìn)行放大5倍規(guī)模的試驗，反應(yīng)后濾除脂肪酶。對酯交換粗產(chǎn)物進(jìn)行分子蒸餾，得到重相分子蒸餾產(chǎn)物(即結(jié)構(gòu)脂質(zhì)產(chǎn)品)。短程分子蒸餾參數(shù)：保溫溫度60℃，刮膜速度120 r/min，進(jìn)料速度100 mL/h，蒸餾溫度150℃，真空度小于10.33 Pa。

1.2.3 脂肪酸組成分析

參考馮紹貴等[16]的方法對樣品進(jìn)行甲酯化，然后進(jìn)行GC分析。GC條件：氫火焰離子化檢測器(FID)；DB-23 石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；注射器溫度250℃，檢測器溫度280℃；升溫程序為初始溫度50℃，以25℃/min升高到175℃，再以3℃/min升高到230℃，保持10 min。以保留時間定性，峰面積歸一化法定量。

1.2.4 Sn-2 脂肪酸位置分析

參考Luddy等[17]的方法制備2-單甘酯。將2-單甘酯轉(zhuǎn)化成脂肪酸甲酯，按1.2.3 GC條件分析脂肪酸組成。

1.2.5 樣品組成及含量測定

采用HPLC-Q-TOF-MS分析油脂樣品甘油三酯、脂肪酸乙酯組成及含量。

HPLC條件：樣品用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為5 mg/mL；進(jìn)樣量5.0 μL；柱溫25℃；流動相流速0.8 mL/min；洗脫程序為采用梯度洗脫，0 min 70%乙腈(A)和30% 丙酮(B)，30 min 50% 乙腈(A)和50% 丙酮(B)。

ELSD蒸發(fā)光散射檢測器條件：蒸發(fā)溫度40℃，霧化溫度45℃，載氣(N2)流速1.6 L/min。

MS條件：采用AB SCIEX Triple TOF 5600系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜分析。參數(shù)設(shè)置為:正離子模式，離子噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550℃；幕狀氣體壓力275 kPa；離子源氣體壓力1.7 MPa；碰撞能量10 eV；掃描范圍250～1 100。使用SCIEX OS軟件(SCIEX)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。

1.2.6 樣品理化性質(zhì)的測定

酸價測定參考GB 5009.229—2016，過氧化值測定參考GB 5009.227—2016，皂化值測定參考GB/T 5534—2008，碘值測定參考GB/T 5532—2008。

1.2.7 體外抗氧化能力的測定

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力

參考Zheng等[18]的方法測定不同質(zhì)量濃度油脂樣品的DPPH自由基清除能力。以油脂質(zhì)量濃度對DPPH自由基清除率作圖，進(jìn)行線性擬合，計算IC50(清除50%自由基所需抗氧化劑樣品質(zhì)量濃度)，以IC50評價油脂對DPPH自由基的清除能力。

1.2.7.2 ABTS自由基清除能力測定

參考Shi等[19]的方法測定不同質(zhì)量濃度油脂樣品的ABTS自由基清除能力。以油脂質(zhì)量濃度對ABTS自由基清除率作圖，進(jìn)行線性擬合，計算IC50，以IC50評價油脂對ABTS自由基的清除能力。

1.2.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)均取3次測定的平均值，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。采用統(tǒng)計分析軟件(IBM SPSS Statistics 23) 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物摩爾比對酯交換反應(yīng)的影響(見圖1)

注：酶載量10% (以底物質(zhì)量計)，反應(yīng)溫度60℃和反應(yīng)時間8 h。不同字母表示顯著性差異，下同。

由圖1可知，底物摩爾比(CCSKO與魚油乙酯摩爾比)從2∶1到1∶1，含EPA/DHA SL含量從(18.15±0.09)%增加到(24.34±0.33)%。底物摩爾比進(jìn)一步增加到1∶2，含EPA/DHA SL含量顯著下降。這是由于合適的底物摩爾比可以增加底物與酶之間的接觸，加快反應(yīng)并快速達(dá)到平衡[20]。但底物摩爾比過高時會引起體系中水解反應(yīng)所產(chǎn)生的副產(chǎn)物增加，從而導(dǎo)致含EPA/DHA SL含量降低。因此，選擇1∶1為最佳底物摩爾比。

2.2 反應(yīng)溫度對酯交換反應(yīng)的影響(見圖2)

注：n(CCSKO)∶n(魚油乙酯)=1∶1，反應(yīng)時間8 h，酶載量10%。

由圖2可知，反應(yīng)溫度從50℃升至60℃，含EPA/DHA SL含量從(17.39±0.57)%增加到(24.34±0.33)%，但隨著反應(yīng)溫度繼續(xù)升高，含EPA/DHA SL含量變化沒有顯著性差異。根據(jù)阿倫尼烏斯方程，反應(yīng)溫度對反應(yīng)速率和反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)有直接影響[21]。反應(yīng)溫度升高可以降低TAG混合物的黏度，增加底物之間的相互作用，促進(jìn)酯交換反應(yīng)的快速平衡[22]。但較高溫度可能會導(dǎo)致油脂氧化，影響產(chǎn)品質(zhì)量。因此，確定最佳反應(yīng)溫度為60℃。

2.3 反應(yīng)時間對酯交換反應(yīng)的影響(見圖3)

注:n(CCSKO)∶n(魚油乙酯)=1∶1,反應(yīng)溫度60℃，酶載量10%。

由圖3可知，8 h內(nèi)含EPA/DHA SL含量明顯增加，從4 h的(17.88±0.77)%增加到(24.34± 0.33)%。但當(dāng)反應(yīng)時間超過8 h后，含EPA/DHA SL含量變化不大，表明8 h時酯化反應(yīng)基本達(dá)到平衡狀態(tài)。Abed等[23]報道長時間高溫反應(yīng)可能致使SL的氧化和?；w移，且反應(yīng)時間越長，EPA/DHA被氧化可能性越大。因此，選擇8 h為最佳反應(yīng)時間。

2.4 酶載量對酯交換反應(yīng)的影響(見圖4)

注:n(CCSKO)∶n(魚油乙酯)=1∶1，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間8 h。

由圖4可知，酶載量從5%增加到10%時，含EPA/DHA SL含量從(15.82±0.39)%增加至(24.34±0.33)%。酶載量增加，增大了底物與酶的接觸機會，含EPA/DHA SL含量會有明顯提高。酶載量超過10%，含EPA/DHA SL含量下降，但沒有顯著性差異，隨后增加酶載量，含EPA/DHA SL含量緩慢增加，這是因為酯交換是一個復(fù)雜的可逆過程，酶載量的增加會促進(jìn)酯交換的逆反應(yīng)和水解反應(yīng)[24]?？紤]SL的產(chǎn)率和酶的成本，選擇酶載量10%進(jìn)行酯交換反應(yīng)。

2.5 脂肪酶的操作穩(wěn)定性

在最佳條件(底物摩爾比1∶1，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間8 h，酶載量10%)下進(jìn)行Novozyme 435脂肪酶操作穩(wěn)定性試驗。結(jié)果見圖5。

圖5 Novozyme 435脂肪酶的操作穩(wěn)定性

由圖5可知，隨著脂肪酶使用次數(shù)的增加，含EPA/DHA SL含量逐漸下降，即酶催化活力有一定降低。酯交換反應(yīng)進(jìn)行到15次時，反應(yīng)產(chǎn)物中含EPA/DHA SL含量為(19.77±0.08)%，脂肪酶的活性依然高達(dá)初始活性的80%以上，表明在最佳反應(yīng)條件下脂肪酶具有較好的操作穩(wěn)定性，具有良好的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

2.6 放大試驗

將酯交換反應(yīng)按底物總量的5倍進(jìn)行了放大，在上述最佳條件下進(jìn)行3批放大試驗。含EPA/DHA SL的含量為(23.55±0.63)%，與小試結(jié)果相似。過濾除去脂肪酶，儲存于-20℃用于后續(xù)純化。

2.7 CCSKO、魚油乙酯、酯交換粗產(chǎn)物、分子蒸餾產(chǎn)物的脂肪酸組成及位置分布(見表1)

由表1可知，CCSKO脂肪酸主要包括癸酸(C10∶0)和月桂酸(C12∶0)，CCSKO中不飽和脂肪酸含量僅為(2.53±0.46)%，主要為油酸和亞油酸，飽和脂肪酸含量高達(dá)(97.47±1.18)%。CCSKO在甘油骨架上的脂肪酸分布表明，Sn-2位和Sn-1,3位脂肪酸的組成和含量大致相同。魚油乙酯中脂肪酸組成主要為EPA、DHA和亞油酸，未檢出MFCA。與CCSKO相比較，酯交換粗產(chǎn)物中MCFA的含量降低到(48.95±0.14)%，不飽和脂肪酸含量升高到(48.14±0.11)%；分子蒸餾產(chǎn)物中MCFA含量降至(74.22±0.70)%，不飽和脂肪酸含量上升到(24.15±0.76)%，其中EPA和DHA含量分別為(11.91±0.44)%和(7.67±1.11)%。與酯交換粗產(chǎn)物相比，分子蒸餾產(chǎn)物中MCFA含量升高，不飽和脂肪酸含量降低，這是由于使用短程分子蒸餾去除了酯交換產(chǎn)物中脂肪酸乙酯和FFA。對分子蒸餾產(chǎn)物的脂肪酸位置組成分布分析發(fā)現(xiàn)，Sn-2位和Sn-1,3位的脂肪酸差異不顯著，因為這是Novozyme 435是酯交換過程中的無位置選擇性脂肪酶。

表1 CCSKO、魚油乙酯、酯交換粗產(chǎn)物和分子蒸餾產(chǎn)物中脂肪酸組成及位置分布 %

2.8 CCSKO、酯交換粗產(chǎn)物、分子蒸餾產(chǎn)物組成及含量(見表2)

由表2可知，CCSKO主要由CCC((5.40±0.01)%)、CCLa((84.78±0.03)%)和MCC/CLaLa((9.82±0.01)%)組成，與Zhao等[25]報道相似。酯交換后，酯交換粗產(chǎn)物中這些TAG含量分別降到(5.15±0.02)%、(15.66±0.43)%和(7.09±0.36)%，脂肪酸乙酯總含量達(dá)(44.15±2.34)%，同時，生成了一些新的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，主要包括CC-EPA、CC-DHA、C-EPA-EPA、CLa-EPA、CLa-DHA和C-O-DHA，含量分別為(6.34±0.08)%、(3.35±0.06)%、(1.48±0.01)%、(6.59±0.27)%、(3.75±0.20)%和(1.85±0.11)%。分子蒸餾產(chǎn)物中未檢出脂肪酸乙酯，CC-EPA、CC-DHA、C-EPA-EPA、CLa-EPA、CLa-DHA和C-O-DHA含量分別為(11.07±0.11)%、(6.71±0.21)%、(2.43±0.03)%、(7.78±0.51)%、(5.99±0.25)%和(1.83±0.06)%，結(jié)構(gòu)脂質(zhì)總含量高達(dá)(44.22±0.57)%。由于分子蒸餾去除了未反應(yīng)的脂肪酸乙酯和FFA，分子蒸餾產(chǎn)物中結(jié)構(gòu)脂質(zhì)含量比酯交換粗產(chǎn)物高。這些結(jié)果表明，CCSKO與魚油乙酯確實發(fā)生了酯交換反應(yīng)，成功地合成了含EPA/DHA的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。酯交換粗產(chǎn)物經(jīng)過分子蒸餾達(dá)到了純化結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的目的，使得結(jié)構(gòu)脂質(zhì)達(dá)到了較高的純度。

表2 HPLC-Q-TOF-MS測定油脂組成及含量

2.9 結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的理化性質(zhì)及體外抗氧化活性

2.9.1 理化性質(zhì)

對分子蒸餾產(chǎn)物的理化性質(zhì)進(jìn)行測定，并與CCSKO、魚油乙酯、酯交換粗產(chǎn)物進(jìn)行對比，結(jié)果如表3所示。

表3 CCSKO、魚油乙酯、酯交換粗產(chǎn)物以及分子蒸餾產(chǎn)物的理化性質(zhì)

由表3可知，分子蒸餾產(chǎn)物的顏色較CCSKO顏色略深些，帶有輕微魚腥味。分子蒸餾產(chǎn)物酸價(KOH)為(0.39±0.08)mg/g，較酯交換粗產(chǎn)物的低，說明分子蒸餾操作除去了酯交換粗產(chǎn)物中的FFA。CCSKO、魚油乙酯、分子蒸餾產(chǎn)物的皂化值(KOH)分別為(283.02±1.02)mg/g、(327.17±0.97)mg/g、(250.31±1.02)mg/g。分子蒸餾產(chǎn)物的皂化值最小，表明其相對分子質(zhì)量最大，說明分子蒸餾產(chǎn)物與CCSKO比較，其中含有較多大相對分子質(zhì)量的ω-3多不飽和脂肪酸。分子蒸餾產(chǎn)物碘值(I)達(dá)到(54.87±0.86)g/100 g，比CCSKO的碘值高，說明分子蒸餾產(chǎn)物中包含了較多的不飽和脂肪酸，皂化值和碘值從側(cè)面反映CCSKO和魚油乙酯通過脂肪酶催化酯交換合成新的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。酯交換粗產(chǎn)物過氧化值為(0.71±0.21)mmol/kg，而分子蒸餾產(chǎn)物的過氧化值為(1.12±0.01)mmol/kg。這可能是分子蒸餾過程中溫度稍高，控制不穩(wěn)定，導(dǎo)致分子蒸餾產(chǎn)物氧化穩(wěn)定性降低。綜上所述，分子蒸餾產(chǎn)物具有良好的理化性質(zhì)，各指標(biāo)符合GB 15196—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食用油脂制品》的有關(guān)規(guī)定，具有應(yīng)用為食用油脂的潛力。

2.9.2 DPPH自由基清除能力(見圖6)

圖6 油脂樣品對DPPH自由基的清除能力

自由基與心血管、癌癥、糖尿病等疾病產(chǎn)生及發(fā)展有密不可分的聯(lián)系[26]。由圖6可知，4種油脂的DPPH自由基清除能力的IC50值由大到小為：CCSKO ((18.04±0.04) mg/mL) > 酯交換粗產(chǎn)物((17.13±0.16)mg/mL)>魚油乙酯((16.99±0.08) mg/mL) > 分子蒸餾產(chǎn)物((13.92±0.18)mg/mL)，CCSKO的DPPH自由基清除能力最弱，分子蒸餾產(chǎn)物的最強。CCSKO中含有一定量α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚[27]，酯交換和分子蒸餾后，這些抗氧化物質(zhì)濃度升高，產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力增強。

2.9.3 ABTS自由基清除能力(見圖7)

圖7 油脂樣品對ABTS自由基的清除能力

由圖7可知，4種油脂的ABTS自由基清除能力IC50值由大到小為CCSKO ((15.28±0.10)mg/mL)>魚油乙酯((14.79±0.10)mg/mL)> 酯交換粗產(chǎn)物((13.15±0.12)mg/mL) > 分子蒸餾產(chǎn)物((8.99±0.05)mg/mL)。分子蒸餾產(chǎn)物的IC50值最小，其ABTS自由基清除能力最強，這與DPPH自由基的清除能力趨勢大致相同。分子蒸餾產(chǎn)物相比于原料油脂有更強的ABTS自由基清除能力。

3 結(jié) 論

本研究在無溶劑體系中通過脂肪酶Novozyme 435催化酯交換反應(yīng)，成功將EPA/DHA摻入到CCSKO中制備成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。通過單因素試驗研究各反應(yīng)因素的影響，優(yōu)化后的反應(yīng)條件為：底物摩爾比1∶1，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間8 h，酶載量10%。在最佳反應(yīng)條件下，含EPA/DHA SL含量為(24.34±0.33)%，且脂肪酶重復(fù)操作穩(wěn)定性良好。分子蒸餾產(chǎn)物中的中、長碳鏈脂肪酸總含量比例約為3∶1，其中EPA和DHA含量分別為(11.91±0.44)%和(7.67±1.11)%。結(jié)構(gòu)脂質(zhì)中含量較高的TAG為CC-EPA((11.07±0.11)%)、CC-DHA((6.71±0.21)%)、CLa-EPA((7.78±0.51)%)和CLa-DHA((5.99±0.25)%)。分子蒸餾產(chǎn)物酸價(KOH)為(0.39±0.08)mg/g，皂化值(KOH)為(250.31±1.02)mg/g，碘值(I)為(54.87±0.86)g/100 g，過氧化值為(1.12±0.01)mmol/kg，對DPPH自由基及ABTS自由基的清除能力IC50值分別為(13.92±0.18)mg/mL及(8.99±0.05)mg/mL，表明分子蒸餾產(chǎn)物符合食用油脂制品的國家標(biāo)準(zhǔn)并具有一定的抗氧化能力。綜上所述，酶法改性CCSKO，加入EPA/DHA合成一種新的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，可顯著提高CCSKO的營養(yǎng)價值及理化性質(zhì)，所合成的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)具有在食品領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。