顧曉穎，金 娜，付曉萍，李凌飛

(1.云南農業(yè)大學 食品科學技術學院，昆明 650201; 2.昆明理工大學 津橋學院,昆明 650106)

花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA)，即順-5, 8, 11, 14-二十碳四烯酸，屬于n-6系列多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，其具有多種藥理功能和營養(yǎng)功效[1-2]。高山被孢霉(Mortierellaalpina)屬于接合菌綱毛霉目被孢霉科被孢霉屬，是一種產油絲狀真菌，目前已作為商業(yè)菌株工業(yè)化生產ARA[3]，且在美國、日本、英國和加拿大已有ARA的發(fā)酵商品投放市場。

優(yōu)化M.alpina發(fā)酵條件是提高ARA產量最直接有效的方法，亦是當前的研究熱點。影響M.alpina中ARA產量的發(fā)酵因素有碳源、氮源、溶氧量、pH、溫度等，其中碳、氮源的種類及濃度對M.alpina的生長及脂肪酸的積累具有較大影響。M.alpina可利用的氮源有無機氮源和有機氮源，不同種類的氮源能影響代謝產物合成的方向和產量[4-6]。在碳過量而氮缺乏條件下，M.alpina代謝平衡被打破，菌株不再繼續(xù)生長而是進入脂質積累期，將過量的碳源以甘油三酯的形式儲存于細胞內[7]。

ARA屬于M.alpina的胞內油，其產量不僅受菌體內脂肪酸含量的影響，同時受菌體生物量的影響。在氮限制條件下，菌體內脂肪酸含量的升高有利于ARA產量的提高，同時氮限制對菌體生長的抑制又會造成ARA產量的降低。目前，關于碳氮比(C/N)如何影響M.alpina中ARA積累的研究甚少。本研究分別以無機氮硝酸鈉和有機氮尿素為氮源，在不同C/N條件下進行M.alpina發(fā)酵實驗，測定發(fā)酵過程中菌體生物量(DCW)、發(fā)酵液殘C量和殘N量、菌體中各脂肪酸組分含量隨時間的動態(tài)變化，明確C/N對M.alpina中ARA積累的影響，以期獲得M.alpina高產ARA的最優(yōu)氮源種類及C/N，為M.alpina工業(yè)化生產ARA提供理論依據(jù)和實際指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

高山被孢霉(M.alpinaD36)，由本實驗室從土壤中分離獲得，并通過形態(tài)學結合分子生物學技術進行了鑒定。

1.1.2 試劑

葡萄糖，酵母浸粉，尿素，硝酸鈉，磷酸二氫鉀，七水硫酸鎂，甲苯，濃硫酸，甲醇，正己烷，氯化鈉，碳酸氫鉀，3, 5-二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉，氫氧化鈉，對二甲氨基苯甲醛，標準品十七烷酸(Sigma公司)等。

1.1.3 儀器

安捷倫5975C-7890A氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，DN-12A干式氮吹儀，LGJ-12冷凍干燥機，TS-211CF往復回旋式搖床，752S紫外分光光度計，YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋，SW-CJ-1C雙人單面凈化工作臺，-80℃低溫冰箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母浸粉6 g/L，KH2PO43 g/L，NaNO33 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

以尿素為氮源，低C/N培養(yǎng)基(C/N 10∶1)配方為葡萄糖 47.86 g/L、尿素4.29 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；中C/N培養(yǎng)基(C/N 20∶1)配方為葡萄糖48.93 g/L、尿素2.14 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；高C/N培養(yǎng)基(C/N 40∶1)配方為葡萄糖49.46 g/L、尿素1.07 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

以硝酸鈉為氮源，低C/N培養(yǎng)基(C/N 10∶1)配方為葡萄糖50 g/L、NaNO312.15 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；中C/N培養(yǎng)基(C/N 20∶1)配方為葡萄糖50 g/L、NaNO36.07 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；高C/N培養(yǎng)基(C/N 40∶1)配方為葡萄糖50 g/L、NaNO33.03 g/L、KH2PO43.8 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

各培養(yǎng)基中初始C質量濃度均為20 g/L；高、中、低C/N條件下培養(yǎng)基中初始N質量濃度分別為0.5、1.0、2.0 g/L。

種子培養(yǎng)基裝液量為50 mL/250 mL，發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為100 mL/500 mL，115℃滅菌15 min。

1.2.2M.alpina發(fā)酵實驗

無菌挑取少量保藏于PDA斜面培養(yǎng)基上的M.alpina菌絲體，轉接于種子培養(yǎng)基中，在前期研究篩選出的最優(yōu)發(fā)酵溫度(20℃)和轉速(175 r/min)[8]下培養(yǎng)3 d。而后挑取10～15個1～2 mm的種子菌球分別轉接于不同C/N的培養(yǎng)基中，20℃、175 r/min下培養(yǎng)，分別于3、6、9、12 d取樣進行檢測分析。

1.2.3 發(fā)酵液中殘C量和殘N量的測定

發(fā)酵液中葡萄糖含量的測定采用3，5-二硝基水楊酸法[9]，尿素含量的測定采用對二甲氨基苯甲醛顯色分光光度法[10]，硝酸鈉含量的測定參照GB 11894—1989《水質 總氮的測定 堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》。

以硝酸鈉為氮源，發(fā)酵液中殘C量=發(fā)酵液中葡萄糖含量×葡萄糖中碳元素質量分數(shù)；發(fā)酵液中殘N量=發(fā)酵液中硝酸鈉含量×硝酸鈉中氮元素質量分數(shù)。C消耗量=培養(yǎng)基中初始C含量-殘C量。

以尿素為氮源，發(fā)酵液中殘C量=發(fā)酵液中葡萄糖含量×葡萄糖中碳元素質量分數(shù)+發(fā)酵液中尿素含量×尿素中碳元素質量分數(shù)，發(fā)酵液中殘N量=發(fā)酵液中尿素含量×尿素中氮元素質量分數(shù)，N消耗量=培養(yǎng)基中初始N含量-殘N量。

1.2.4 菌體生物量(DCW)的測定。

采用干重法測定。發(fā)酵完成后，真空抽濾分離發(fā)酵液和菌體，蒸餾水洗滌菌體3次。收獲的菌體至-20℃預凍24 h后真空冷凍3 d，稱重。菌體生物量以每升發(fā)酵液中干菌體的質量表示。

1.2.5 脂肪酸組成的測定

參照文獻[8, 11]，向50 mg凍干的菌絲粉中加入1 mL甲苯、2 mL 1%硫酸甲醇溶液和1 mL質量濃度為1 mg/mL的十七烷酸作為內標，于50℃過夜，然后采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)對形成的脂肪酸甲酯進行定性和定量分析。GC-MS的參數(shù)設置參照Gu等[8]的方法。菌體中各脂肪酸含量，以每克凍干菌絲粉中所含脂肪酸的毫克數(shù)表示。菌體總脂肪酸(TFA)含量為菌體中各脂肪酸含量之和，以ARA含量與TFA含量的比例計算ARA比例，以菌體中ARA含量與菌體生物量乘積計算ARA產量。

1.2.6 統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One Way ANOVA)，各組之間均值的兩兩比較采用Duncan多重比較法。對不同C/N條件下C消耗量、N消耗量、DCW、TFA含量、ARA產量進行Pearson相關性分析。

2 結果與討論

2.1 以硝酸鈉為氮源，不同C/N條件下的發(fā)酵實驗

2.1.1 不同C/N對菌體生長的影響(見圖1)

由圖1可見：以硝酸鈉為氮源，高C/N條件下真菌生長最快；發(fā)酵時間相同時(除3 d)，高C/N條件下DCW顯著高于中、低C/N條件；高C/N條件下發(fā)酵12 d，DCW最高，為6.42 g/L，是低C/N條件下的2.3倍。可見，低濃度硝酸鈉(即高C/N條件)有利于菌體生長，原因可能是低濃度硝酸鈉有利于菌體對C、N的消耗吸收。

注：圖中字母相同表示無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，反之有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。下同。

2.1.2 不同C/N對C消耗量的影響(見圖2)

圖2 硝酸鈉為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間發(fā)酵液殘C量

由圖2可見：以硝酸鈉為氮源，發(fā)酵液初始C含量相同(20 g/L)，但高C/N培養(yǎng)基中殘C量較低，表明高C/N有利于M.alpina消耗發(fā)酵液中的C；相同發(fā)酵時間下，高C/N培養(yǎng)基中C消耗量最大，其次是中C/N；發(fā)酵結束時，高、中、低C/N條件下發(fā)酵液中殘C量分別為10.68、13.81、16.05 g/L，即C消耗量分別為9.32、6.19、3.95 g/L。高C/N條件下的C消耗量是低C/N條件下C消耗量的2.36倍，是中C/N條件下的1.51倍。

2.1.3 不同C/N對N消耗量的影響(見圖3)

由圖3可見，以硝酸鈉為氮源，M.alpina的N消耗量與發(fā)酵液中的初始N濃度相關。隨著發(fā)酵時間的延長，高C/N條件下發(fā)酵液殘N量下降明顯，表明高C/N條件下真菌對N的消耗更快。發(fā)酵結束時，各個濃度下發(fā)酵液中的N均未耗盡，高、中、低C/N條件下發(fā)酵液中殘N量分別為0.21、0.83、1.88 g/L，即N消耗量分別為0.29、0.17、0.12 g/L。高C/N條件下N消耗量是低C/N條件下的2.4倍。

圖3 硝酸鈉為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間發(fā)酵液殘N量

2.1.4 不同C/N對菌體中TFA含量和ARA比例的影響(見圖4、圖5)

圖4 硝酸鈉為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間菌體中的TFA含量

圖5 硝酸鈉為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間TFA中ARA的比例

由圖4可見，以硝酸鈉為氮源，M.alpina干菌體中TFA含量的變化無明顯規(guī)律性。發(fā)酵3 d和12 d時，高、中C/N條件下菌體中TFA含量顯著高于低C/N條件下的；而發(fā)酵6 d和12 d時，高、中、低C/N 條件下的TFA含量沒有統(tǒng)計學差異。

由圖5可見，以硝酸鈉為氮源，TFA中ARA比例在19.13%～33.77%之間。發(fā)酵9 d和12 d時，高、中、低C/N條件下 ARA比例均無統(tǒng)計學差異。中C/N條件下，ARA比例隨發(fā)酵時間延長呈現(xiàn)先升高而后降低的趨勢，發(fā)酵6 d時ARA比例最高，為33.77%。高、低C/N條件下ARA的比例隨發(fā)酵時間的延長沒有統(tǒng)計學差異。

2.1.5 不同C/N對ARA產量的影響(見圖6)

圖6 硝酸鈉為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間ARA的產量

由圖6可見:以硝酸鈉為氮源，C/N對ARA產量的影響與對DCW的影響一致；ARA產量隨發(fā)酵時間的延長逐漸升高，相同發(fā)酵時間下ARA產量的趨勢為高C/N>中C/N>低C/N。發(fā)酵12 d，高C/N條件下ARA產量為0.21 g/L，是中C/N條件下的1.75倍，是低C/N條件下的4.67倍。以硝酸鈉為氮源，高C/N有利于M.alpina發(fā)酵生產ARA，主要是由于高C/N條件下所獲DCW更高。

2.1.6 不同C/N條件下各變量之間的Pearson相關系數(shù)(見表1)

表1 以硝酸鈉為氮源時不同C/N條件下各變量之間的Pearson相關系數(shù)

續(xù)表1

由表1可見：高、中、低C/N條件下DCW與C消耗量和N消耗量呈顯著正相關，并且，中、低C/N條件下C消耗量與N消耗量也呈顯著正相關；TFA含量與DCW、C消耗量、N消耗量無顯著相關性；高、中、低C/N條件下，ARA產量與DCW呈顯著正相關，Pearson相關系數(shù)分別為0.688、0.508和0.603。

綜上，以硝酸鈉為氮源，雖然高、中C/N條件下菌體中TFA含量和ARA比例整體沒有顯著差異，但由于高C/N條件下DCW最高，故ARA產量也最高。其原因可能是在較差的無機氮條件下，M.alpina的C消耗量較低，攝入的有限C僅能滿足M.alpina的生存需求，由于M.alpina生長狀態(tài)較差，胞內代謝物積累量也較低。

2.2 以尿素為氮源，不同C/N條件下的發(fā)酵實驗

2.2.1 不同C/N對菌體生長的影響(見圖7)

圖7 尿素為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間的菌體生物量

由圖7可見：隨著發(fā)酵時間的延長，同一發(fā)酵時間不同C/N條件下DCW差異逐漸增大；發(fā)酵3 d和6 d時，各C/N條件下DCW差異不大；發(fā)酵12 d時，低C/N條件下DCW顯著高于中、高C/N條件下，為18.2 g/L。結合圖1可見，以尿素為氮源，DCW明顯高于以硝酸鈉為氮源。

2.2.2 不同C/N對C消耗量的影響(見圖8)

由圖8可見：發(fā)酵12 d，發(fā)酵液中的C均未耗盡，高C/N條件下發(fā)酵液中殘C量為9.55 g/L(發(fā)酵液中初始C含量相同，均為20 g/L)，即C消耗量為10.45 g/L，C消耗率為52.3%；中C/N條件下殘C量為4.53 g/L，即C消耗量為15.47 g/L，C消耗率為77.4%；低C/N條件下殘C量為4.39 g/L，即C消耗量為15.61 g/L，C消耗率為78.1%。發(fā)酵后期(9 d和12 d)，中、低C/N條件下C的消耗量顯著高于高C/N條件。

圖8 尿素為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間發(fā)酵液殘C量

2.2.3 不同C/N對N消耗量的影響(見圖9)

圖9 尿素為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間發(fā)酵液殘N量

由圖9可見，不同C/N條件下發(fā)酵液中殘N量隨發(fā)酵時間的延長急劇下降。高C/N條件下，發(fā)酵液中的N在9 d時消耗殆盡；中C/N條件下發(fā)酵9 d時，發(fā)酵液中殘N量僅為0.1 g/L，發(fā)酵結束(12 d)時N消耗率為92.5%；低C/N條件發(fā)酵12 d時，殘N量為0.65 g/L，N消耗率僅為67.5%。

2.2.4 不同C/N對菌體中TFA含量和ARA比例的影響(見圖10、圖11)

由圖10可見，以尿素為氮源，隨發(fā)酵時間的延長，菌體中TFA含量不斷增加。同一發(fā)酵時間，高、中C/N條件下菌體中TFA含量明顯高于低C/N條件；發(fā)酵結束時高C/N條件下菌體中TFA含量達305 mg/g(干基)。故高、中C/N條件有利于M.alpina積累TFA。

圖10 尿素為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間菌體中的TFA含量

由圖11可見，以尿素為氮源，TFA中ARA比例在20.67%～34.32%之間。隨發(fā)酵時間的延長，高、中、低C/N條件下菌體中ARA比例呈現(xiàn)相同的變化趨勢，即發(fā)酵3 d時ARA含量最低，從6 d起ARA含量無統(tǒng)計學差異。在各發(fā)酵時間點，高、中、低C/N條件下 ARA比例也無統(tǒng)計學差異。表明以尿素為氮源，不同C/N條件對菌體中ARA的比例幾乎無影響。

2.2.5 不同C/N對ARA產量的影響(見圖12)

圖12 尿素為氮源，不同C/N條件下不同發(fā)酵時間的ARA產量

由圖12可見，以尿素為氮源，中C/N條件有利于M.alpina生產ARA。發(fā)酵3 d和6 d時，高、中、低C/N條件下ARA產量沒有統(tǒng)計學差異。發(fā)酵12 d時，中C/N條件下ARA產量為0.99 g/L，顯著高于高、低C/N條件。對比圖6可以看出，以尿素為氮源，ARA產量明顯高于以硝酸鈉為氮源。

2.2.6 不同C/N條件下各變量之間的Pearson相關系數(shù)(見表2)

表2 以尿素為氮源時不同C/N條件下各變量之間的Pearson相關系數(shù)

由表2可見，以尿素為氮源，高、中、低C/N條件下DCW與C消耗量、N消耗量均呈顯著正相關，該結果與以硝酸鈉為氮源時一致。與硝酸鈉不同的是，以尿素為氮源，中、低C/N條件下TFA含量與C消耗量也呈正相關，表明消耗的C一部分滿足菌體生長，另一部分則通過正常代謝積累TFA。在尿素為氮源、高C/N條件下，TFA含量與DCW無明顯相關性，而與C消耗量呈顯著正相關，表明當菌株處于N饑餓條件下，菌體生長緩慢甚至不生長，發(fā)酵液中消耗的C大量流向TFA積累途徑[12]。

總之，以尿素為氮源，中C/N條件有利于提高M.alpina的ARA產量。雖然隨著發(fā)酵時間的延長，低C/N條件下M.alpina的生長優(yōu)勢逐漸凸顯(DCW最高)，但其菌體中TFA含量較低，ARA比例也較低，導致ARA產量較低；雖然中、高C/N條件下菌體中TFA含量及ARA比例沒有顯著差異，但隨著發(fā)酵時間的延長，9 d時高C/N條件下發(fā)酵液中的N被耗盡，抑制了菌體生長，最終導致ARA產量不高。

3 結 論

本研究基于不同氮源及不同C/N條件下M.alpina的生長狀況和脂肪酸積累分析，明確了C/N對M.alpina中ARA產量的影響效應。以無機氮硝酸鈉為氮源，高C/N條件有利于M.alpina發(fā)酵生產ARA，但生物量和ARA產量遠低于以有機氮尿素為氮源的；以尿素為氮源，低C/N條件下獲得了較高的DCW，但低C/N條件下菌體中TFA含量和ARA比例較低，故ARA產量不高。本研究表明有機氮更有利于M.alpina菌體生長和ARA的積累，以尿素為氮源，在中C/N條件下可獲得較高的ARA產量。