王蔚新,張 俊,占劍峰,吳 鵬,胡 婷,沈峻峰

(湖北省經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，黃岡師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)資源學(xué)院，湖北 黃岡 438000)

麻城福白菊為菊科多年生草本植物，以麻城市福田河鎮(zhèn)為主產(chǎn)區(qū)，故稱為麻城福白菊，簡稱福白菊，屬國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，湖北重要的道地藥材[1]。產(chǎn)區(qū)常年菊花種植面積2 700 hm2產(chǎn)量4 600 t，是全國最大的菊花生產(chǎn)基地，與浙江桐鄉(xiāng)、江蘇鹽城并稱中國藥用保健白菊花三大產(chǎn)地。麻城福白菊具有“朵大肥厚、花瓣玉白、花蕊深黃，湯液清澈、金黃帶綠，氣清香，味甘醇美”等品質(zhì)特征，具有散風(fēng)清熱、明目解毒之功效。

研究表明，菊花主要化學(xué)成分有多糖類、黃酮類及揮發(fā)油類等，其中多糖類具有抗氧化、抗衰老、降低血糖、調(diào)節(jié)脂代謝和抗輻射等功能，并能增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗病能力等生物活性功能[2-4]。與杭白菊、貢菊等知名品種相比，福白菊的知名度略遜一籌，相關(guān)理化及生物活性研究也較少。本研究采用水提醇沉法提取福白菊胎菊與朵菊粗多糖，并通過測定其總抗氧化能力及三種自由基清除能力研究其體外抗氧化活性，旨在篩選一種天然食品抗氧化劑，同時為福白菊的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

福白菊朵菊和胎菊購自湖北麻城，干燥后粉碎，過50目篩，于干燥、避光環(huán)境中密封冷藏。

葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無水乙醇、無水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、濃鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì),上海菁華科技儀器有限公司；H/T18MM型臺式高速離心機(jī),湖南赫西儀器裝備有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵,上海亞榮生化儀器廠；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠；FA2004型電子天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；LGJ-12型真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 福白菊粗多糖的提取

參照陳云[5]的方法，并略有改動。準(zhǔn)確稱取福白菊朵菊和胎菊粉末各10 g，以料液比1∶25 (g/mL)加入蒸餾水，提取溫度為90 ℃，提取時間為2 h，提取液5000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀重復(fù)提取兩次，合并上清液并過濾。將濾液于60 ℃條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后的體積為原來體積的1/4～1/3，向濃縮后的提取液中加入95%的乙醇溶液，搖勻，4 ℃醇沉12 h，4000 r/min離心5 min，棄上清液，收集絮狀沉淀，冷凍干燥至恒重，得到粗多糖，并按公式計(jì)算提取率。

粗多糖提取率%=粗多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100%

1.4 粗多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[6]測定菊花粗多糖中多糖的含量。

1.5 粗多糖抗氧化測定

1.5.1總抗氧化能力

采用Fe3+還原能力測定的方法[7]。配置不同濃度的樣液(抗壞血酸、福白菊胎菊粗多糖及朵菊粗多糖)，分別取1 mL于試管中，加入2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖液，搖勻后加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混勻后于50 ℃反應(yīng)20 min。再加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，3000 r/min離心10 min，取上清液5 mL，并加入5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，反應(yīng)30 min后，于700 nm處測吸光值(A)。以蒸餾水作為參比液測其吸光值(A0)。每個樣品試驗(yàn)3次，取3次試驗(yàn)的平均值。

總抗氧化能力:△A=A-A0

式中：A-添加樣品的吸光值，A0-空白對照液吸光值。

1.5.2DPPH自由基清除能力

參照馮燕茹等人[8]的方法，并略有改動。配置不同濃度的樣液(抗壞血酸、福白菊胎菊粗多糖及朵菊粗多糖)，分別取4 mL于試管中，加入4 mL 0.15 mmol/L的DPPH·乙醇溶液，混勻后避光靜置30 min，于517 nm處測其吸光值(Ax)；以無水乙醇作為參比液測其吸光值(A0)；取樣品與等體積無水乙醇混合(不加入其它試劑)，測其吸光值(Ax0)。每個樣品試驗(yàn)3次，取3次試驗(yàn)的平均值。

DPPH自由基清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%

式中：Ax-添加樣品的吸光值，Ax0-樣品與無水乙醇等體積混合液吸光值，A0-空白對照液吸光值。

1.5.3羥基自由基清除能力

采用水楊酸法[9-10]，并略有改動。配置不同濃度的樣液(抗壞血酸、福白菊胎菊粗多糖及朵菊粗多糖)，分別取2 mL于試管中，加入6 mmol/L FeSO4溶液和6 mmol/L H2O2溶液各2 mL，室溫下靜置10 min后，再加入6 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，搖勻，室溫下靜置30 min后，于510 nm處測其吸光值(Ax)；以蒸餾水作為參比液測其吸光值(A0)；重復(fù)上述試驗(yàn)，將水楊酸溶液換成蒸餾水測其吸光值(Ax0)。每個樣品試驗(yàn)3次，取3次試驗(yàn)的平均值。

羥基自由基清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%

式中：Ax-添加樣品和水楊酸的吸光值，Ax0-添加樣品和蒸餾水的吸光值，A0-空白對照液吸光值。

1.5.4超氧陰離子自由基清除能力

參照王麗霞等人[11]的方法，并略有改動。配置不同濃度的樣液(抗壞血酸、福白菊胎菊粗多糖及朵菊粗多糖)，加入5.7 mL 6mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)于試管中， 37 ℃條件下保溫20 min，然后依次加入不同濃度樣品溶液各2 mL，再加入0.1 mL 6mmol/L的鄰苯三酚溶液，搖勻，于37 ℃反應(yīng)6 min，最后加入1 mL 0.1 mol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，于320 nm處測其吸光值(Ax)；以蒸餾水作為參比液測其吸光值(A0)；重復(fù)上述試驗(yàn)，將鄰苯三酚溶液換成蒸餾水測其吸光值(Ax0)。每個樣品試驗(yàn)3次，取3次試驗(yàn)的平均值。

超氧陰離子自由基清除率=[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%

式中：Ax-添加樣品和鄰苯三酚的吸光值,Ax0-添加樣品和蒸餾水的吸光值,A0-空白對照液吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊花粗多糖的提取率與含量比較分析

冷凍干燥得到福白菊朵菊和胎菊粗多糖提取物，經(jīng)計(jì)算提取率分別為11.12%、10.47%。陳云[5]采用水提醇沉法提取杭白菊多糖，提取率達(dá)到11.74%，與本研究結(jié)果相近。

苯酚-硫酸法測定多糖含量。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X，g/L)，在490 nm處吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。回歸方程為y=10.257x+0.0019，R2=0.9979。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of glucose

結(jié)果表明，福白菊朵菊和胎菊粗多糖中的多糖含量分別為64.01%、55.32%(以葡萄糖計(jì))。同樣利用水提醇沉法，楊春[12]等提取野菊、杭菊粗多糖，含量分別為19.03%、49.52%；馬力等[13]從金菊花中提取多糖成分，并用苯酚-硫酸法測定其多糖含量，結(jié)果表明提取的多糖含量為86.59%；陸穎[14]利用熱水、酶輔助、稀堿水提取的野菊花粗多糖，含量分別為16.43%、30.19%和30.19%。由此可見，各種菊花粗多糖的含量因菊花品種、采收階段及提取工藝不同而存在較大差異。

2.2 福白菊粗多糖體外抗氧化分析

2.2.1總抗氧化能力表現(xiàn)比較

總抗氧化能力是測定抗氧化性的重要指標(biāo)之一，通過測定體系中Fe3+-Fe2+的轉(zhuǎn)化程度來確定多糖總抗氧化能力的強(qiáng)弱。由圖2可見，在0.1～0.7 g/L之間，隨著濃度的增加，福白菊胎菊與朵菊粗多糖總抗氧化能力均呈上升趨勢，且朵菊粗多糖總抗氧化能力略大于胎菊(P<0.01)，兩者存在極顯著差異。同時，以VC的總抗氧化能力強(qiáng)弱作為對照，胎菊和朵菊粗多糖的總抗氧化能力均低于同等濃度的VC。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.7 g/L時，朵菊和胎菊粗多糖的總抗氧化能力分別為0.427和0.395，為同等濃度VC的17.4%和16.1%。表明福白菊朵菊與胎菊具有一定的總抗氧化能力。劉宇琪等[15]采用水提醇沉法提取同源靈芝子實(shí)體和孢子粉中的多糖，經(jīng)過分離純化，得到4種多糖并進(jìn)行體外抗氧化研究，結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為1.0 g/L時，這4種多糖總抗氧化能力依次為0.283、0.728、0.291和0.471，均低于VC。

圖2 VC、胎菊與朵菊粗多糖總抗氧化能力比較Fig. 2 Total antioxidant capacity of VC and crude polysaccharide from chrysanthemum Fubai (Taiju and Duoju)

2.2.2DPPH自由基

DPPH自由基在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)溶液中存在自由基清除劑時，DPPH的孤對電子被配對，其在517 nm處吸收會減弱，通過測定吸收減弱的程度，可評價自由基清除劑的活性[16]。由圖3可見，在0.1～0.4 g/L之間時，隨著質(zhì)量濃度增大，福白菊胎菊與朵菊粗多糖DPPH自由基清除率呈上升趨勢；當(dāng)質(zhì)量濃度超過0.4 g/L時，福白菊胎菊與朵菊粗多糖DPPH自由基清除率趨于平緩。在0.1～0.7g/L濃度范圍內(nèi)，朵菊的清除能力均略大于胎菊(P<0.01)，兩者存在極顯著差異。以VC的DPPH自由基清除能力的強(qiáng)弱作為對照，在同等濃度下，胎菊和朵菊粗多糖的DPPH自由基清除能力低于VC。當(dāng)濃度達(dá)到0.7 g/L時，朵菊和胎菊粗多糖的DPPH自由基清除率即可達(dá)到93.39%、91.50%，相當(dāng)于同等濃度下VC的97.73%、95.75%，因此具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。鄭昌平[17]以懷菊花為原料，經(jīng)提取、分離純化，得到9種均一多糖組分，并進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)，各個多糖樣品都表現(xiàn)出一定的DPPH自由基的清除能力，清除能力隨著濃度增加而增加，當(dāng)濃度為1.0 g/L時，CMJA0S2多糖組分的清除能力最強(qiáng)，達(dá)到81%，具有明顯的抗氧化保護(hù)作用。

圖3 VC、胎菊與朵菊粗多糖DPPH自由基清除能力比較Fig. 3 DPPH· scavenging ability of VC and crude polysaccharide from chrysanthemum Fubai (Taiju and Duoju)

2.2.3羥基自由基

羥基自由基是一種毒性較強(qiáng)的活性氧自由基，對生物機(jī)體具有很強(qiáng)的破壞作用，主要氧化損傷細(xì)胞中的生物大分子[18]。由圖4可知，當(dāng)福白菊胎菊與朵菊粗多糖濃度在0.1～0.7 g/L時，清除率呈上升趨勢，當(dāng)濃度大于0.3 g/L時，朵菊的清除能力大于胎菊(P<0.01)，兩者存在極顯著差異。當(dāng)濃度為0.7 g/L時，福白菊朵菊與胎菊粗多糖對羥基自由基清除率為51.12%、46.55%，相當(dāng)于同等濃度下VC的65.08%、59.26%。因此，福白菊胎菊和朵菊粗多糖對羥自由基均具有一定的清除作用。杜萍等[19]利用落葉松銹迷孔菌產(chǎn)胞外多糖進(jìn)行抗氧化研究，結(jié)果表明，隨著多糖濃度的增加，清除羥自由基的能力不斷增強(qiáng)，當(dāng)濃度為2.0 g/L時，落葉松銹迷孔菌胞外多糖對羥自由基的清除率可達(dá)到77.64%，高于1.4 g/L濃度下VC對羥自由基的清除率(77.21%)，具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

圖4 VC、胎菊與朵菊粗多糖羥基自由基清除能力比較Fig. 4 ·OH scavenging ability of VC and crude polysaccharide from chrysanthemum Fubai (Taiju and Duoju)

2.2.4超氧陰離子自由基

超氧陰離子在體內(nèi)較容易產(chǎn)生，而抗氧化劑能清除超氧陰離子，使鄰苯三酚的氧化產(chǎn)物在波長320 nm處的吸收峰受到抑制，通過檢測中間產(chǎn)物的生成量，可測定抗氧化劑對超氧陰離子的清除能力[20]。由圖5可知，隨著質(zhì)量濃度的增加，福白菊胎菊與朵菊粗多糖溶液對超氧陰離子自由基清除率不斷增大，且朵菊的超氧陰離子自由基清除能力略大于胎菊 (P<0.01)，兩者存在極顯著差異。當(dāng)質(zhì)量濃度0.7 g/L時，朵菊和胎菊粗多糖溶液對超氧陰離子自由基清除率分別達(dá)到39.06%、34.55%，相當(dāng)于同等濃度的條件下VC的64.96%、57.46%。因此，福白菊胎菊和朵菊粗多糖對超氧陰離子自由基均具有一定的清除作用。熊磊等[21]從滁菊醇提藥渣中用纖維素酶法提取多糖，研究滁菊多糖抗氧化性，結(jié)果表明，滁菊多糖濃度范圍在0.2～1.0 g/L 時，對超氧陰離子自由基的清除率為8.66%～48.26%，滁菊多糖的濃度為1.0 g/L的超氧陰離子自由基清除率超過0.2 g/L的VC。

圖5 VC、胎菊與朵菊粗多糖超氧陰離子自由基清除能力比較Fig. 5 scavenging ability of VC and crude polysaccharidefrom chrysanthemum Fubai (Taiju and Duoju)

本研究以水提醇沉法獲得福白菊胎菊和朵菊的粗多糖，并對不同濃度粗多糖進(jìn)行抗氧化性能測定。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，福白菊胎菊與朵菊粗多糖均具有較強(qiáng)的總抗氧化能力，以及清除超氧陰離子自由基、DPPH自由基、羥基自由基能力，且其總抗氧化能力、自由基清除能力與其濃度均呈量效關(guān)系，表明其具有良好的體外抗氧化作用。雖然福白菊胎菊與朵菊粗多糖體外抗氧化活性弱于VC，但在一定濃度范圍內(nèi)仍能體現(xiàn)出良好的抗氧化性質(zhì)，這對天然抗氧化劑的篩選具有一定的研究和應(yīng)用價值。