李巖巖 陸淼炯

[摘要] 目的 分析姜黃素通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用及對(duì)細(xì)胞活性影響。方法 選取2017年4月～2018年3月期間為研究時(shí)間段，以此期間購(gòu)置的肝癌SMMC-7721細(xì)胞為試驗(yàn)樣本，利用不同濃度姜黃素處理試驗(yàn)樣本，先經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，后經(jīng)CCK8法分別在試驗(yàn)開(kāi)始后24 h檢測(cè)其細(xì)胞活力，再經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞ROS含量。 結(jié)果 姜黃素濃度越高，肝癌細(xì)胞存活率呈逐步下降趨勢(shì)，同空白對(duì)照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）;姜黃素濃度越高，MFI值呈逐步升高趨勢(shì)，同空白對(duì)照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）;不同濃度姜黃素處理的試驗(yàn)樣本細(xì)胞凋亡率，呈逐漸上升趨勢(shì)，與空白對(duì)照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）。 結(jié)論 利用姜黃素可有效地抑制肝癌細(xì)胞活性，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路;肝癌SMMC-7721細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞活性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2020）22-0041-04

Effect of curcumin on apoptosis of liver cancer SMMC-7721 cells induced by endoplasmic reticulum stress signaling pathway and its effect on cell viability

LI Yanyan? ?LU Miaojiong

Department of Anorectal Surgery， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? ?310007， China

[Abstract] Objective To analyze the effect of curcumin on apoptosis of liver carcinoma cell line SMMC-7721 through endoplasmic reticulum stress signaling pathway and its effect on cell viability. Methods The period from April 2017 to March 2018 was selected as the study period. The liver cancer SMMC-7721 cells purchased during this period were used as test samples. The test samples were treated with different concentrations of curcumin， and the apoptosis of cells were first detected by flow cytometry. Then the cell viability was detected by CCK8 method 24 h after the start of the experiment. And the ROS content of liver cancer cells was detected by flow cytometry. Results The higher the concentration of curcumin， the lower the survival rate of liver cancer cells. Compared with that of the blank control samples， the data showed significant difference（P<0.05）. The higher the curcumin concentration， the higher the MFI value. Compared with that of the blank control samples， the data showed significant difference（P<0.05）. The apoptosis rate of the samples treated with different concentrations of curcumin showed a gradual increase trend， which was significantly different from that of the blank control group（P<0.05）. Conclusion Curcumin can effectively inhibit the activity of liver cancer cells and induce apoptosis of liver cancer cells.

[Key words] Curcumin; Endoplasmic reticulum stress signaling pathway; Liver cancer SMMC-7721 cells; Apoptosis; Cell viability

原發(fā)性肝癌在臨床上并不少見(jiàn)，由于肝癌早期多無(wú)臨床表現(xiàn)，或無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，故很容易被忽略，往往在體檢中發(fā)現(xiàn)，而一旦出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，多已經(jīng)發(fā)展至中晚期，嚴(yán)重威脅患者生命安全[1-2]。我國(guó)是全世界范圍內(nèi)肝癌發(fā)病的重災(zāi)區(qū)，多經(jīng)手術(shù)治療，但部分患者病情已經(jīng)惡化，發(fā)展至晚期，或因其他原因?qū)е拢瑹o(wú)法接受手術(shù)治療，則可采取放療、化療及介入方式[3]進(jìn)行治療。但小肝癌治療方案現(xiàn)仍存在一定的爭(zhēng)議，而且肝癌治療存在一定的個(gè)體化差異。目前，中醫(yī)中藥在肝癌治療方面的作用現(xiàn)已逐步受到臨床醫(yī)務(wù)人員、患者及家屬的重視。姜黃素多源自姜科中藥根莖，色黃味苦，水溶性較差，但能溶于有機(jī)溶劑內(nèi)。姜黃素多呈結(jié)晶粉末狀，廣泛用于食品添加及染色產(chǎn)業(yè)中[4]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠抗炎、抗氧化，而且在動(dòng)脈粥樣硬化性病變的防控中也能發(fā)揮較好的作用。上世紀(jì)末，國(guó)外學(xué)者首次提出利用姜黃素治療癌癥，隨后幾十年至今，發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠遏制多種癌癥的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。由于肝癌發(fā)病早期診斷難度較大，且治療性藥物存在毒副作用及耐藥性，故將姜黃素納入肝癌的防控方案相關(guān)研究課題。本次研究以2017年4月～2018年3月期間購(gòu)置的肝癌SMMC-7721細(xì)胞為試驗(yàn)樣本，分析在不同姜黃素處理下的細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡情況差異。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究選取2017年4月～2018年3月期間為研究時(shí)間段，以在此期間購(gòu)置的肝癌SMMC-7721細(xì)胞為試驗(yàn)樣本，購(gòu)自中科院上海生物科學(xué)研究院。

1.2 試劑與儀器

本次研究主要試驗(yàn)儀器及試劑：（1）RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)自上海博升生物科技有限公司。（2）Gibco胎牛血清，購(gòu)自上海江林生物科技有限公司。（3）elF2α，購(gòu)自美國(guó)Sigma。（4）巴玖SAF-680T型酶標(biāo)儀，購(gòu)自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司。（5）貝克曼庫(kù)爾特MoFlo XDP流式細(xì)胞儀，來(lái)自默瑞上海生物科技有限公司。（6）CCK 8法檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。（7）高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。（8）超凈試驗(yàn)臺(tái)，購(gòu)自深圳市金天地實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司。（9）姜黃素，購(gòu)自美國(guó)Sigma。（10）DHP-9012恒溫培養(yǎng)箱，來(lái)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。（11）PBS緩沖液，購(gòu)自賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司。（12）奧林巴斯CX 33顯微鏡，購(gòu)自成貫儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)? 將肝癌SMMC-7721細(xì)胞試驗(yàn)樣本、Gibco胎牛血清（10%）、青霉素（濃度100 U/mL）及鏈霉素（100 U/mL）置于培養(yǎng)基內(nèi)，送入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在環(huán)境溫度37℃以及CO2（5%）條件下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞≥80%時(shí)，達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)使用標(biāo)準(zhǔn)。利用胰酶（0.25%質(zhì)量分?jǐn)?shù)）對(duì)貼壁細(xì)胞消化后，傳代與凍存細(xì)胞比例為1∶3。

1.3.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)? 取肝癌SMMC-7721細(xì)胞試驗(yàn)樣本（對(duì)數(shù)，且處于生長(zhǎng)期內(nèi)）接種在6孔板上，每孔接種細(xì)胞數(shù)量控制在106個(gè);送入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在環(huán)境溫度37℃以及CO2（5%）條件下進(jìn)行培養(yǎng)，過(guò)夜后，分組如下：第一組為無(wú)姜黃素僅加細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)后肝癌細(xì)胞的空白對(duì)照樣本，第二組在空白對(duì)照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度25 μmol/L），第三組在空白對(duì)照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度50.0 μmol/L）。PBS預(yù)冷后，洗滌收集好的細(xì)胞;加入Annexin V-FIT后，輕搖混勻，在室溫避光條件下進(jìn)行孵育，將時(shí)間控制在15 min;孵育后在1000 r/min條件下送入離心機(jī)內(nèi)，離心5 min后，去除上清液，獲取重懸細(xì)胞，再次加入預(yù)冷PBS緩沖液及PI染色劑后，輕搖，待混勻后，在環(huán)境溫度4℃及避光條件下保存，利用流式細(xì)胞儀對(duì)上述混懸細(xì)胞液進(jìn)行檢測(cè);本次試驗(yàn)重復(fù)3次后，取平均值。

1.3.3 肝細(xì)胞存活率檢測(cè)? 取肝癌SMMC-7721細(xì)胞試驗(yàn)樣本（對(duì)數(shù)，且處于生長(zhǎng)期內(nèi)）接種在96孔板上，每孔接種細(xì)胞數(shù)量控制在5000個(gè)，分組試驗(yàn)，第一組為無(wú)姜黃素僅加細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)后肝癌細(xì)胞的空白對(duì)照樣本，第二組在空白對(duì)照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度25.0 μmol/L），第三組在空白對(duì)照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度50.0 μmol/L）;每組平行孔5個(gè);在環(huán)境溫度37℃，以及5%的條件下進(jìn)行培育，時(shí)間1 d。1 d后，注入CCK8溶液，用量10 μL，在37℃的環(huán)境溫度下孵育，時(shí)間1 h;經(jīng)酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm條件下對(duì)吸光度進(jìn)行檢測(cè)，觀(guān)察并記錄A值;本次試驗(yàn)重復(fù)3次后，取平均值。

1.3.4 細(xì)胞ROS含量檢測(cè)? 取肝癌SMMC-7721細(xì)胞試驗(yàn)樣本（對(duì)數(shù)，且處于生長(zhǎng)期內(nèi)）接種在6孔板上，每孔接種細(xì)胞數(shù)量控制在106個(gè);送入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在環(huán)境溫度37℃以及CO2（5%）條件下進(jìn)行培養(yǎng)，過(guò)夜后，分組方案如下：分組試驗(yàn)，第一組為無(wú)姜黃素僅加細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)后肝癌細(xì)胞的空白對(duì)照樣本，第二組在空白對(duì)照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度25 μmol/L），第三組在空白對(duì)照樣本基礎(chǔ)上加入姜黃素（濃度50.0 μmol/L）;在無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)加入DCFH-DA（濃度10.0 μmol/L）后，將收集的細(xì)胞加入其中，在37℃環(huán)境下進(jìn)行孵育，時(shí)長(zhǎng)20 min，經(jīng)PBS漂洗2次后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析熒光強(qiáng)度;其中，以MFI值表示ROS含量;本次試驗(yàn)重復(fù)3次后，取平均值。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)

（1）不同濃度姜黃素條件下細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果分布，分析不同濃度姜黃素處理的試驗(yàn)樣本細(xì)胞凋亡率差異。（2）不同濃度姜黃素條件下細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果分布，即檢測(cè)不同濃度姜黃素條件下，肝癌細(xì)胞存活率以及MFI值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度姜黃素條件下肝癌細(xì)胞凋亡率比較

姜黃素濃度越高，肝癌細(xì)胞存活率越低，同空白對(duì)照組比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 不同濃度姜黃素條件下肝癌細(xì)胞存活率及MFI值比較

姜黃素濃度越高，肝癌細(xì)胞存活率呈逐步下降趨勢(shì)，同空白對(duì)照樣本比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;姜黃素濃度越高，MFI值呈逐步升高趨勢(shì)，同空白對(duì)照樣本比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 肝癌的診斷及治療

肝癌在我國(guó)發(fā)病率較高，這與國(guó)內(nèi)乙肝群體數(shù)量較高有關(guān)[5-6]。肝癌惡化程度多較高，且病情發(fā)展速度較快，患者生存時(shí)間較短，治療難度較大，嚴(yán)重威脅患者生命安全。到本世紀(jì)初，全世界范圍內(nèi)的肝癌患者超過(guò)一半在中國(guó)。肝癌在臨床上的診斷及治療方案諸多，但以病理作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)[7-8]，而治療方案除放化療及手術(shù)治療以外，還包括介入治療、免疫治療[9]及靶向治療[10]等。手術(shù)治療主要包括肝部分切除、肝移植等。而介入治療是微創(chuàng)治療方法的一種，現(xiàn)已證實(shí)該方案在抑制腫瘤生長(zhǎng)、延長(zhǎng)患者生存時(shí)間、提高其生存率方面，能夠發(fā)揮良好的臨床效果。介入方法主要包括兩大類(lèi)型，其一為血管介入方法，其二為非血管介入方法。血管介入方法以肝動(dòng)脈化療栓塞方法及肝動(dòng)脈灌注化療方案為代表性方案，適用于無(wú)法接受手術(shù)治療的肝癌患者，或不能經(jīng)手術(shù)切除的患者，比如小肝癌。而且，在肝動(dòng)脈化療栓塞方案中，化療藥物在肝組織局部緩慢釋放，能夠產(chǎn)生化療的效果，適用于中晚期患者。非血管介入方法則以局部消融方案[11]為代表方案，即經(jīng)皮穿刺后，將導(dǎo)管送至肝腫瘤，再利用物理及化學(xué)方法對(duì)瘤體進(jìn)行破壞，比如無(wú)水乙醇注射，或局部熱消融治療方案，或125I放射粒子植入治療[12]。

3.2 姜黃素

姜黃素屬于一種色素，脂溶性較好，能夠清除肝組織內(nèi)的氧自由基，同時(shí)對(duì)肝組織內(nèi)的炎性反應(yīng)具有一定的抑制作用[13-14]。姜黃素主要產(chǎn)自姜黃，而莪術(shù)及郁金等其他藥材內(nèi)同樣含有姜黃素。在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，姜黃功效主要包括溫經(jīng)行氣、破血止痛。目前，姜黃素已經(jīng)成為相關(guān)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)課題。其中姜黃素的藥理作用[15]主要包括：（1）抗腫瘤，抗腫瘤增生，提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感度，通過(guò)對(duì)腫瘤組織轉(zhuǎn)錄因子及生長(zhǎng)因子等靶點(diǎn)的作用效果，發(fā)揮其抗腫瘤及殺滅腫瘤細(xì)胞的作用，或通過(guò)抑制MMP-2的表達(dá)，或腫瘤組織內(nèi)VECF及bFGF的表達(dá)，發(fā)揮其降低腫瘤擴(kuò)散的作用;誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡，比如激活Caspase-8/9/3[16]，提高ADP活性，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，降低NF-等因子表達(dá)。（2）抗炎，減低巨噬細(xì)胞活性，促使蛋白激酶的激活，同時(shí)抑制促炎反應(yīng)活性酶活性，適用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急性肺損傷等疾病的治療。（3）其他作用，比如抗氧化作用，抗病毒作用，保護(hù)神經(jīng)及抗纖維化作用。

3.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)

利用藥物作用、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種因素，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而可致使內(nèi)環(huán)境紊亂、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的通路較多，而通過(guò)激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[17-18]。本次研究中，姜黃素濃度越高，肝癌細(xì)胞存活率呈逐步下降趨勢(shì)，同空白對(duì)照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）;姜黃素濃度越高，MFI值呈逐步升高趨勢(shì)，同空白對(duì)照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）;不同濃度姜黃素處理的試驗(yàn)樣本細(xì)胞凋亡率，呈逐漸上升趨勢(shì)，與空白對(duì)照樣本比較，有顯著性差異（P<0.05）。研究證實(shí)[19-20]，姜黃素濃度越高，肝癌細(xì)胞活性越差，肝癌細(xì)胞凋亡率越高，姜黃素可有成效抑制肝癌細(xì)胞活性，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。但本次研究存在一定的局限性，比如研究時(shí)間較短，未與臨床病理結(jié)合等，如有需要，可延長(zhǎng)研究時(shí)間，或與臨床病理結(jié)合進(jìn)行研究。

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（收稿日期：2019-10-15）