王文英，劉喜存，郭春江，宋微微，董彥琪，馬曉紅

（1.河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.山東省種子管理總站，山東 濟(jì)南 250013）

瓜類作物較難在自然條件下產(chǎn)生單倍體，國內(nèi)外主要通過原位雌核發(fā)育、離體雄核發(fā)育和離體雌核發(fā)育途徑獲得單倍體植株。未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)屬于離體雌核發(fā)育途徑，是將未授粉子房或胚珠從母體上分離出來，在無菌的環(huán)境下接種到合適的培養(yǎng)基上進(jìn)而發(fā)育成單倍體胚、植株的過程。利用該技術(shù)可有針對性地篩選出符合目標(biāo)性狀的材料，并迅速獲得純系材料，縮短育種年限；因此，節(jié)省大量的人力和物力，提高了育種效率。未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)在植物遺傳學(xué)研究、育種實踐中具有很高的利用價值，可為植物育種研究奠定堅實的理論基礎(chǔ)[1]。

國內(nèi)外眾多學(xué)者研究表明，影響瓜類作物未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)的因素很多，本文針對以下幾個主要因素進(jìn)行綜合性論述：植株的基因型、植株的生長季節(jié)、胚囊發(fā)育時期、低溫預(yù)處理、熱激處理、接種方式、培養(yǎng)基類型等。

1 影響瓜類作物未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)技術(shù)的因素

1.1 植株的基因型

植株的基因型對植物未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)有重要的影響。大量植物的離體雌核發(fā)育研究表明，不同供體材料中不同基因型之間即使在相同的培養(yǎng)條件下發(fā)育結(jié)果也有所不同。Li等[2]研究發(fā)現(xiàn)，采用雜交組合后代為材料的誘導(dǎo)效果比定型品種的效果要好。陳小鵬等[3]、徐靜[4]分別以黃瓜、西葫蘆的未授粉子房或胚珠為材料進(jìn)行離體培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同基因型對未授粉子房或胚珠的離體培養(yǎng)效果影響不同。謝冰[5]在西葫蘆雌核離體培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)基因型不同導(dǎo)致離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)率存在明顯的差異。劉栓桃等[6]對9個不同基因型西葫蘆材料的未授粉胚珠誘導(dǎo)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，其雌核離體培養(yǎng)存在明顯的基因型差異，再生植株率最高的能達(dá)到33.33%，而最低的僅為2.67%。Shalaby[7]對12種不同基因型南瓜品種的未授粉雌花子房培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，不同材料的胚誘導(dǎo)率、成苗率都存在著較大的差異。杜勝利等[8]以生長在同一春季大棚中的“津春3號”和“津雜2號”黃瓜品種為試材，取未受精子房進(jìn)行離體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)“津春3號”的胚芽和愈傷誘導(dǎo)率均高于“津雜2號”。Ficeadenti等[9]研究了2個甜瓜品種及其雜交種的未授粉雌花子房培養(yǎng)，結(jié)果表明品種的出胚率較雜交種的出胚率高。周林[10]研究表明，6種基因型的西瓜未受粉子房愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生率存在明顯差異。

從以上試驗可以看出，基因型是影響未授粉子房胚胎發(fā)生的重要因素之一，有時甚至是決定因素，選擇合適的基因型是植物未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。

1.2 供體植株的生長季節(jié)

供體植株的生長季節(jié)對未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)的影響也是十分顯著的，這可能與植株的生理生長特性有關(guān)。魏愛民等[11]研究了在不同生長季節(jié)，黃瓜離體雌核發(fā)育的單倍體胚胎發(fā)生率和植株再生率的區(qū)別，結(jié)果表明：在溫度相對較高的6月下旬、7月上旬以及9月份其培養(yǎng)效果要明顯高于其他月份。在生長發(fā)育前期，供體植株單倍體再生率相對較高且穩(wěn)定，但隨著供體植株逐漸衰老，其未受粉子房培養(yǎng)的污染率不斷上升，同時發(fā)現(xiàn)種植于塑料大棚內(nèi)的供體材料比種植在露地中的供體材料具有更高的單倍體胚胎發(fā)生率和成苗率。盛慧[12]研究結(jié)果表明，秋季生長的黃瓜材料誘導(dǎo)率要高于春季，且不易污染，而冬季的誘導(dǎo)效果則一般。Przyboromwski等[13]在黃瓜單倍體誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，春季材料的誘導(dǎo)率很低，僅是夏季材料誘導(dǎo)率的1/4。謝冰[5]研究發(fā)現(xiàn)，不同播期的西葫蘆材料的胚狀體發(fā)生率存在極顯著差異，秋播材料的誘導(dǎo)率最高，夏播與春播的誘導(dǎo)率都很低。陳解放[14]、孫守如等[15]在南瓜上的試驗結(jié)果也證實胚狀體發(fā)生和小苗的誘導(dǎo)集中在7月中旬和8月中旬。

綜上可見，不同植物的胚狀體誘導(dǎo)率在不同季節(jié)呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，選取合適季節(jié)的供體可大大提高其誘導(dǎo)率。

1.3 胚囊發(fā)育時期

不同作物種類、品種間胚囊發(fā)育時期對離體雌核發(fā)育的影響存在差異。陳學(xué)軍等[16]認(rèn)為，處于成熟胚囊期即開花當(dāng)天的西葫蘆未受精子房的胚狀體、愈傷組織誘導(dǎo)率、再生植株率最高。劉栓桃等[6]對不同西葫蘆材料進(jìn)行不同開花時期取材試驗，結(jié)果表明開花當(dāng)天的胚珠最適合誘導(dǎo)培養(yǎng)，再生植株發(fā)生率最高。葛志東等[17]認(rèn)為開花前1 d的西葫蘆未受精胚珠誘導(dǎo)再生植株率最高，其次為開花當(dāng)天，開花前2 d的胚珠誘導(dǎo)再生植株率最低。陳解放[14]研究表明，開花當(dāng)天的南瓜未受精子房的胚狀體誘導(dǎo)率、成苗率均最高，這可能是花器內(nèi)源激素在開花當(dāng)日達(dá)到較高水平的緣故。孫守如等[15]發(fā)現(xiàn)，開花前1 d的南瓜胚珠已成熟或接近成熟，誘導(dǎo)率較高。韓麗華[18]對胚囊發(fā)育途徑做切片觀察，發(fā)現(xiàn)厚皮甜瓜開花前14 h胚囊處于接近成熟胚囊的狀態(tài)，經(jīng)熱激和硝酸銀誘導(dǎo)，可使卵器細(xì)胞繼續(xù)分裂，胚囊內(nèi)卵器分裂形成胚狀體，萌發(fā)形成單倍體植株。在刁衛(wèi)平等[19]的黃瓜試驗中發(fā)現(xiàn)，開花前1～4 d的子房均可誘導(dǎo)獲得胚芽，但以開花前2～3 d的子房胚芽誘導(dǎo)率最高。

從以上試驗可以看出，胚囊發(fā)育時期對胚狀體的誘導(dǎo)至關(guān)重要，不能僅憑開花時間來判斷胚囊發(fā)育時期，不同材料在不同的開花時期所處的胚囊發(fā)育時期也不盡相同，試驗材料的播種時期、雌花的發(fā)育時期及雌花的部位等對胚誘導(dǎo)頻率都有著重要的影響[20]。

1.4 接種前外植體的預(yù)處理

1.4.1 低溫處理

低溫預(yù)處理是花藥培養(yǎng)中比較常見的培養(yǎng)方法。祝仲純等[21]認(rèn)為，在單倍體培養(yǎng)過程中，需要先對外植體進(jìn)行一定的預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)，如低溫處理、高溫?zé)峒ぬ幚?、黑暗處理等，使植株或外植體細(xì)胞的生理生化狀態(tài)、細(xì)胞分裂方式或細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)發(fā)生一定的改變，從而提高愈傷組織誘導(dǎo)率、單倍體植株再生率。Kwack等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，南瓜胚珠在5 ℃冷處理2 d后，其體細(xì)胞胚的再生頻率得到了提高。低溫預(yù)處理極有可能改變雌核發(fā)育途徑，從而導(dǎo)致單倍體胚形成。

1.4.2 熱激處理

熱激處理溫度對愈傷組織或胚狀體的形成以及促進(jìn)其生長都有重要作用。陳小鵬等[3]發(fā)現(xiàn)，黃瓜未受精子房誘導(dǎo)胚狀體的最佳預(yù)處理溫度為35 ℃。Shalaby[7]研究表明南瓜品種“Queen F1”在32 ℃熱激處理4 d時效果最佳。葛志東等[17]研究顯示，35 ℃熱激處理5 d能夠有效啟動西葫蘆雌核發(fā)育，提高離體雌核發(fā)生率。徐靜[4]也發(fā)現(xiàn)，35 ℃熱激處理5 d對大多數(shù)西葫蘆品種的子房培養(yǎng)有效，可明顯地促進(jìn)葫蘆科植物的雌核發(fā)育。Diao等[23]研究表明，在35 ℃條件下對黃瓜的離體雌核進(jìn)行熱激處理3 d的誘導(dǎo)率比熱激處理2、4 d的效果好?？梢?，大多數(shù)植物的最佳預(yù)處理溫度均為35 ℃，不同的植物預(yù)處理的天數(shù)有所不同。

1.5 接種方式

植物材料的接種方式直接影響到離體雌核對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收效率，從而影響雌核的發(fā)育。陳學(xué)軍等[16]比較了4種接種方法對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，發(fā)現(xiàn)橫切分法接種的胚珠最先長出愈傷組織，誘導(dǎo)率最高達(dá)28%。杜勝利等[8]發(fā)現(xiàn)，將黃瓜未授粉子房切成2～3 mm的薄片平放接種在離體培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)效果最佳。周林[10]也發(fā)現(xiàn)，切片法使西瓜胎座組織與培養(yǎng)基接觸面積增大，促進(jìn)充分吸收營養(yǎng)，生長旺盛。這可能是因為橫切分法造成外植體產(chǎn)生較大的創(chuàng)傷面，使其對養(yǎng)分的吸收能力得到提高，從而激發(fā)外植體形成愈傷組織。

1.6 培養(yǎng)基

目前，在多數(shù)研究報道中，研究人員使用MS或改良MS培養(yǎng)基進(jìn)行瓜類作物未授粉子房或胚珠的離體培養(yǎng)。陳學(xué)軍等[16]采用MS培養(yǎng)基進(jìn)行西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)。謝冰[5]采用N6培養(yǎng)基進(jìn)行西葫蘆未受精胚珠離體培養(yǎng)，認(rèn)為培養(yǎng)基對西葫蘆胚狀體誘導(dǎo)頻率影響較大，篩選的M3、M2培養(yǎng)基有較大的利用價值。此外，韓麗華[18]也使用MS培養(yǎng)基進(jìn)行厚皮甜瓜的離體雌核誘導(dǎo)試驗。

2 問題與展望

前人已在黃瓜、西葫蘆、西瓜、甜瓜、南瓜等瓜類作物上應(yīng)用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)技術(shù)，并獲得了單倍體胚和單倍體植株，為研究離體雌核發(fā)育機(jī)制，開展更廣泛的未授粉胚珠、單倍體培養(yǎng)方法奠定了基礎(chǔ)。瓜類離體雌核發(fā)育、胚狀體的形成及成苗過程涉及的影響因素更為復(fù)雜，還存在許多亟待解決的問題，如建立高效穩(wěn)定的誘導(dǎo)體系、快速鑒定多倍體的倍性以及在組織、器官、細(xì)胞及分子水平的生長發(fā)育機(jī)理等。

國內(nèi)外眾多學(xué)者利用未授粉子房或胚珠培養(yǎng)技術(shù)在不同的瓜類作物上已做了不少的研究工作，也在基因型、胚囊發(fā)育時期、接種方式、植株生長季節(jié)、植物生長調(diào)節(jié)劑、低溫預(yù)處理、熱激處理等方面做了大量的研究和探索，發(fā)現(xiàn)上述影響因素并不是孤立存在的，而是由多種因素共同作用、相互影響、協(xié)同作用；因此，植物未授粉子房或胚珠等離體雌核培養(yǎng)尚需大量的后續(xù)研究工作以逐漸完善該技術(shù)。