陳隆全

（重慶市綦江區(qū)東溪鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 401434）

豬瘟是由豬瘟病毒引發(fā)的接觸性傳染病，病死率高，傳染速度快，一旦大范圍傳播，必然給養(yǎng)殖戶造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，威脅我國(guó)養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展。由于豬瘟病毒臨床表現(xiàn)朝向非典型發(fā)展，在臨床診斷病豬時(shí)受到多種因素感染，很難快速準(zhǔn)確地提供診斷結(jié)果，延誤早期隔離，增加了豬瘟傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料和方法

由重慶市動(dòng)物疫病防控中心提供豬瘟病毒陽性對(duì)照材料，將病死豬扁桃體和淋巴結(jié)進(jìn)行取樣備用。準(zhǔn)備RT-PCR 試劑盒、RNA 試劑盒。

2 設(shè)計(jì)合成引物

使用RT-PCR 合成特異性引物，設(shè)計(jì)擴(kuò)增片段為682bp。

3 制備樣品

對(duì)病死豬進(jìn)行剖檢，在無菌環(huán)境下采集扁桃體和淋巴結(jié)，研磨后添加生理鹽水進(jìn)行稀釋處理。設(shè)定5000r/s 經(jīng)過5min 離心處理，取上層清液為樣品。

4 提取病毒基因組總RNA

按照試劑盒說明，取 100μL 上層清液，添加至 1.5mlEP 管中，加入 SolutionR1 100μL?；旌虾笳袷?30s，放在室溫環(huán)境中靜置 60s。經(jīng)過處理后，添加 SolutionR2 600μL，經(jīng)過充分混合顛倒后，在室溫環(huán)境下靜置3～5min。添加上層清液后套離心管，再次進(jìn)行30s 離心處理。將外套管內(nèi)部液體倒出，添加Wash Buffer 600μL，經(jīng)過 30s 離心處理后，將接液管內(nèi)部液體倒出，要進(jìn)行兩次洗滌處理。將空柱放在10000r/min 離心處理，1min 后轉(zhuǎn)移至新離心管中。在新離心管中轉(zhuǎn)入Spin column，膜中央添加 20～50μL Elution Buffer，在室溫環(huán)境中靜置60s，經(jīng)過 30s 離心處理后，可以得到 RNA，可以在-70℃下保存或者直接擴(kuò)增處理。

5 擴(kuò)增處理

將總 RNA 為模板擴(kuò)增，取 0.4μL 上下游引物，設(shè)定 45℃，經(jīng)過 30min 反轉(zhuǎn)錄后，升高至 94℃進(jìn)行 5min 預(yù)變。在 94℃下經(jīng)過 30s 變性，設(shè)定 52℃進(jìn)行 45s 退火。在 72℃下進(jìn)行 45s 的延伸，重復(fù)35 個(gè)循環(huán)。在72℃下進(jìn)行10min 延伸。

6 熒光定量擴(kuò)增

以總 RNA 為模板擴(kuò)增，取 0.4μL 上下游引物，0.4μL 探針 ，0.4μL Passive Reference Dye，1μLRNA 模 板 。并 使 用RNase-free Water，添加至 20μL。設(shè)定擴(kuò)增程序，設(shè)定 45℃，經(jīng)過 25min 反轉(zhuǎn)錄后，升高至 95℃進(jìn)行 2min 預(yù)變[1]。在 95℃下經(jīng)過 10s 變性，設(shè)定 55℃進(jìn)行 30s 退火。在 72℃下進(jìn)行 30s的延伸，重復(fù) 5 個(gè)循環(huán)。在 95℃下進(jìn)行 10s 變性，在 55℃下進(jìn)行30s 退火，經(jīng)過40 個(gè)循環(huán)，結(jié)束后對(duì)熒光進(jìn)行收集。

7 檢測(cè)結(jié)果

7.1 判定標(biāo)準(zhǔn)

檢測(cè)Ct 值不超過35，擴(kuò)增曲線表現(xiàn)出明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，可以判斷樣本為陽性。若Ct 值處于35～40 之間，需要進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)，Ct 值仍然處于這一范圍，擴(kuò)增曲線出現(xiàn)指數(shù)增長(zhǎng)期，可以判斷為陽性，否則樣本為陰性。若沒有檢測(cè)到Ct 值，或者樣本Ct 值超過了40，可以判斷樣本為陰性。

7.2 擴(kuò)增結(jié)果

提取樣本總RNA 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增處理，使用1%瓊脂糖凝膠對(duì)產(chǎn)物電泳，對(duì)照陽性片段。在682bp 附近，樣品有帶則可以確定樣本為豬瘟病毒陽性。

7.3 熒光定量擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用熒光定量RT-PCR 方法檢測(cè)豬瘟病毒，檢測(cè)結(jié)果為陽性。和RT-PCR 一致，代表病豬已感染豬瘟病毒。

8 討論

早期診斷對(duì)控制豬瘟的擴(kuò)散十分關(guān)鍵，需要根據(jù)病豬發(fā)病情況，及早采取先進(jìn)技術(shù)，診斷豬瘟，才能有效控制豬瘟，避免豬瘟蔓延。PCR 技術(shù)得到深入研究，逐漸在動(dòng)物疫病檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)可以取代傳統(tǒng)血清學(xué)和病原分離鑒定方法[2]。檢測(cè)試驗(yàn)通過借鑒成熟檢測(cè)技術(shù)，在獸醫(yī)診斷中得到廣泛應(yīng)用，有效減少檢測(cè)時(shí)間，讓檢測(cè)結(jié)果特異性和精準(zhǔn)性得到顯著提高，降低豬瘟給養(yǎng)殖行業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失。RT-PCR 技術(shù)的應(yīng)用顯著提高了檢測(cè)效率，規(guī)避樣本污染及假陽性結(jié)果的問題。借助于熒光定量PCT 檢測(cè)的高特異性和高靈敏性，讓豬瘟病原體檢測(cè)快捷準(zhǔn)確。

9 結(jié)語

綜上所述，使用RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)豬瘟病毒，可快速靈敏的完成豬瘟檢測(cè)，指導(dǎo)病豬臨床診斷，提高診斷效率?？焖佾@得診斷結(jié)果后，能將豬瘟病豬快速隔離，采取科學(xué)合理的防治手段，避免豬瘟病毒的傳播，減少養(yǎng)殖戶經(jīng)濟(jì)損失。