董玉迪 張 曼 田 娟 孫墨可 郭來春

（吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 吉林白城 137000）

植物是生態(tài)環(huán)境中十分重要的組成部分，也是人類重要的食物和營養(yǎng)來源。特別是在植物種子中，富含大量的氨基酸1-α、氨基-γ-（胍基氧基）、正丁酸及其他游離氨基酸，十分有益于人體健康，例如，1-瓜氨酸是非必需氨基酸卻時常參與器官間代謝，它也參與一氧化氮信號分子的產(chǎn)生，并且是有效的血管擴張劑。有鑒于此，對植物種子中的游離氨基酸進行分析對于確定植物種子的質(zhì)量等非常重要[1]。由于氨基酸成分的測定方法很多，在實踐中研究人員很難選擇出恰當?shù)臏y定方法，以保障植物種子的氨基酸測定在較大的線性范圍內(nèi)，確保植物種子氨基酸成分測定的精度、準確性和可重復(fù)性。因此，迫切需要針對現(xiàn)階段常用的氨基酸測定方法加以比較。

1 氨基酸成分測定方法

現(xiàn)代氨基酸成分分析測定方法有很多，例如，毛細管電泳、氣相色譜、qNMR 和液相色譜等氨基酸成分測定方法[2]。用于氨基酸衍生化的試劑有6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯（AQC）、9-芴基甲基-氯甲酸酯（FMOC-Cl）、異硫氰酸苯酯（PITC）、丹磺酰氯（DNS）和鄰苯二甲醛（OPA）。由于酸性、堿性和中性行為及其關(guān)鍵對的存在，氨基酸的分離具有挑戰(zhàn)性。關(guān)鍵對緊密洗脫氨基酸衍生物，例如甘氨酸、β-丙氨酸和蛋氨酸。通過RP-HPLC 使用熒光（FLD）、紫外線和二極管陣列檢測器（DAD）進行氨基酸測定，通常在柱前衍生化后進行。但是，這些氨基酸成分測定方法或多或少都有弊端。例如，茚三酮雖然是最通用的檢測方法，但當需要定量低于100皮摩爾的氨基酸時，其有效性會下降；鄰苯二甲醛盡管具有出色的靈敏度，但亞胺酸定量分析效果較差；PTC 化學(xué)試劑提供了一種可行的替代方法，但是與樣品相關(guān)的基質(zhì)效應(yīng)會導(dǎo)致谷氨酸和天冬氨酸的回收率可變。

分析氨基酸純度，同樣有許多方法。例如，針對校準物雜質(zhì)的紫外線檢測的高效液相色譜法（HPLC-UV/Vis）或具有火焰離子化檢測的氣相色譜法（GC-FID）等[3]。但是，這些方法通常會遭受非色譜分離的困擾，導(dǎo)致與雜質(zhì)相關(guān)的巨大不確定性，使得雜質(zhì)無法得到充分校準，必須再次進行來源或合成然后表征。因此，需要進一步開發(fā)用于氨基酸成分測定的方法。通過IEC結(jié)合茚三酮進行柱后衍生化測定氨基酸的方法，研究人員研制了全自動儀器，例如，日立L-8800 分析儀和日立L-8900 分析儀等，使這種分析在常規(guī)基礎(chǔ)上可行，將氨基酸測定提升到新的高度，并應(yīng)用于許多領(lǐng)域的研究中。此外，將氣相色譜儀與同位素比值質(zhì)譜儀（IRMS）儀器（GC-C-IRMS）連接起來的燃燒接口的概念，允許使用單個加標化合物對多種有機物進行柱后IDMS 分析，來確定同位素標記尖峰的質(zhì)量流，并且可以在25 ℃下快速進行[4]。

2 氨基酸成分測定方法的比較

2.1 使用方法的比較

使用C 8 色譜柱分離氨基酸，并通過HPLC-FLD 進行氨基酸成分測定需要使用到氨基酸標準品、三水合乙酸鈉、鹽酸、2-巰基乙醇、HPLC 級甲醇、乙腈、β-丙氨酸和OPA、1-鳥氨酸、冰醋酸、Brij-35、硼酸鈉、HPLC 級水。首先將50 mg OPA溶于1.25 mL HPLC級甲醇中，然后將11.1 mL 40 mmol/L 硼酸鈉，0.5 mL 3.1%Brij-35 和50 μL 2-巰基乙醇（ME）溶解。

使用HPLC 系統(tǒng)分離氨基酸。通過由Instant Pilot 型號G4208 A 控制的1260 Infinity 熒光檢測器進行檢測[5]。該系統(tǒng)對PE Nelson 900 接口和PE Nelson 600 鏈接盒進行了調(diào)整。流動相由（A）20 mmol/L 乙酸鈉緩沖液和（B）乙腈/甲醇/水（50 /32 /18）組成。通過以下梯度程序?qū)崿F(xiàn)了28 分鐘的氨基酸分離：等度20% B，持續(xù)4 分鐘，在2分鐘內(nèi)從20%B 逐漸增加到32% B，4 分鐘內(nèi)從32%～34% B 逐漸增加，然后增加3 分鐘，從34% B 增至38% B，然后在9 分鐘內(nèi)線性增加至95% B，保持等度5% B 2 分鐘，然后在1 分鐘內(nèi)恢復(fù)到初始狀態(tài)20% B 并保持等度4 分鐘。流速為0.6 mL / min，進樣量為5μL。衍生化過程是自動化的；在進樣之前，將100 μL OPA 的等分試樣用自動進樣器吸收，并添加到含有果汁樣品或氨基酸標準溶液的HPLC 小瓶中。將OPA 樣品混合物在25±1 ℃下孵育2 分鐘。然后立即通過HPLC-FLD 分析反應(yīng)混合物。為了檢測氨基酸，將熒光檢測器的激發(fā)和發(fā)射分別設(shè)置在340 nm 和455 nm。

使用NHS-醋酸鹽和DEPC 進行氨基酸測定需要使用到NHS-醋酸鹽、DEPC、咪唑、用于MS 的所有溶劑和添加劑（HPLC 級）。將15 mmol/L NHS 乙酸酯溶于33%（體積比）乙腈（ACN）中，并用水按1:10 稀釋。將PBS中的50 pmol ADH或PK 與0.1%的NHS-乙酸鹽混合，最終體積為20 μL，并在23 ℃下孵育15 分鐘。隨后，添加NuPAGE LDS 樣品緩沖液和還原劑，并使用NuPAGE Bis-Tris 凝膠進行凝膠電泳。用NHS-乙酸酯標記的蛋白質(zhì)在凝膠中水解。為此，從凝膠上切下蛋白條帶，然后用10 mmol/L 二硫蘇糖醇還原蛋白，用55 mmol/L 碘乙酰胺烷基化，并用胰蛋白酶（Roche）水解。用水將DEPC 稀釋至0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、2.5 mmol/L 和5 mmol/L。將HEPES 中的50 pmol ADH 或PK 與0、2、10、50 和100 摩爾過量的DEPC 混合，并在37 ℃和500 rpm 下孵育1 分鐘。通過在冰上添加1μL 10 mmol/L咪唑來終止標記反應(yīng)。隨后，將蛋白質(zhì)以3 體積沉淀。100%（體積比）冰冷的乙醇和1/10 體積0.5 mol/L 乙酸鈉pH 5.3，然后在-20 ℃下孵育2 小時。離心分離蛋白質(zhì)，并用80%（體積比）乙醇洗滌沉淀，并在真空離心機中干燥。將通過凝膠水解或溶液水解獲得的肽溶解在2%（體積比）ACN / 0.1%（體積比）FA 中，并加載到反相C18 預(yù)柱濃縮肽。使用0.1% FA（體積比）作為流動相A，使用80%（體積比）ACN / 0.1%（體積比）FA 作為流動相B，然后在反相C18 分析柱上分離多肽，在70 分鐘內(nèi)以300/min 的流速以90%乙醇的梯度洗脫。將這些肽直接洗脫到Q Exactive Plus 混合四極桿Orbitrap 質(zhì)譜儀中，并以數(shù)據(jù)依賴模式進行分析。

2.2 測定結(jié)果的比較

使用C8 色譜柱分離氨基酸，并通過HPLC-FLD 進行氨基酸成分測定將儲備溶液進一步稀釋以制成最終濃度為2.5 μg/mL 的溶液。然后將最終濃度依次稀釋為0.08μg/ mL、0.16μg/ mL、0.32μg/ mL、0.64μg/ mL、1.28μg/ mL，用于校準曲線。通過注入5μL 連續(xù)稀釋的標準溶液評估不同氨基酸的校準曲線的線性。通過繪制HPLC 峰面積相對于其濃度的曲線來獲得校準圖。分別以3 和10 的信噪比（S /N）確定檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。通過標準氨基酸混合物和樣品的重復(fù)性和中間精度評估優(yōu)化該方法的精度。該方法的可重復(fù)性通過連續(xù)3 天每天從預(yù)定的連續(xù)進樣（n= 5）中獲得的單個峰面積的相對標準偏差（%RSD）進行評估。

使用NHS-醋酸鹽和DEPC 進行氨基酸測定，在評估標記氨基酸的反應(yīng)性時，幾乎所有的氨基酸都被NHS-乙酸鹽和DEPC 標記，這表明氨基酸的反應(yīng)性很高。從技術(shù)角度來看，NHS-乙酸酯標記的可重復(fù)性高于觀察到的DEPC 標記。相較于以前的結(jié)果，在評估賴氨酸殘基的標記百分比時，似乎經(jīng)常在NHS 標記中觀察到較高的標記百分比；對于少量氨基酸，使用DEPC 時觀察到更高的標記百分比。通過儀器徹底轉(zhuǎn)移纈氨酸的進一步檢查，將使用與色譜柱后IDMS 相同的色譜法（但不添加峰）的纈氨酸的碳同位素增量與離線獲得的相同同位素增量進行比較。如果這兩個同位素δ值之間存在顯著差異，則纈氨酸中的少量雜質(zhì)具有高度異常的同位素δ值，或者在色譜分離過程中存在纈氨酸的分餾現(xiàn)象。

3 結(jié)論

植物種子的氨基酸成分測定，關(guān)鍵在于衍生試劑的選擇。選擇衍生試劑的標準是能與各氨基酸定量反應(yīng)，每種氨基酸只生成一種化合物且產(chǎn)物有一定的穩(wěn)定性，不產(chǎn)生或易于排除干擾物；操作簡單，色譜分離分辨率高，檢測靈敏度高，分析時間短，便于實現(xiàn)自動化和使產(chǎn)物能在不同型號的高效液相色譜儀上測定。當然，不同衍生物所選用的柱型、流動相以及氨基酸的洗脫時間和順序也不盡相同。