趙明娟 崔鴻博 劉乾

（北京市懷柔區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 101400）

血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)是新城疫和高致病性禽流感診斷技術(shù)之一[1，2]，也是新城疫和高致病性禽流感免疫抗體檢測(cè)的重要方法。1%雞紅細(xì)胞懸液是該項(xiàng)試驗(yàn)中的重要試劑之一，準(zhǔn)確配制是保證試驗(yàn)結(jié)果正確的重要因素。筆者通過(guò)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)了配制該試劑各個(gè)環(huán)節(jié)需要注意的內(nèi)容，希望能為從業(yè)人員提供參考，不足之處歡迎批評(píng)指正。

1 采集血液

根據(jù)國(guó)標(biāo)[1，2]要求，需要采集至少3 只SPF 或無(wú)禽流感和新城疫抗體的非免疫雞的抗凝血。實(shí)際操作中也可采集1 只符合條件的公雞血液。每5ml 的血液能獲得約2ml 的紅細(xì)胞。一般采集公雞翅靜脈血，一人保定公雞，一人用5ml 一次性注射器采集血液。采血前需用酒精棉球?yàn)椴杉课幌荆瑫r(shí)可以起到濕潤(rùn)羽毛，起暴露血管的作用，便于采血者操作。

2 抗凝處理

2.1 阿氏液處理

將采集的血液與阿氏液以1：1 的比例混合，輕輕地充分搖勻，在4℃環(huán)境下可保存兩周。阿氏液的量一定要大于血液量，否則容易造成血液凝固，有結(jié)塊，影響血球懸液的制備。實(shí)際工作中，若需要的量較小，可將阿氏液放于15ml 或50ml 扣蓋離心管中，再將采集的血液沿管壁緩緩注入與其混合?；靹驎r(shí)切忌劇烈震蕩，避免紅細(xì)胞破裂。

2.2 1：9 的枸櫞酸鈉真空貯血管處理

周志民等[3]通過(guò)試驗(yàn)證明，采用1：9 的枸櫞酸鈉真空貯血管可以替代阿氏液。具體做法是將采集的符合要求的公雞血液直接注入抗凝管中，每管不超過(guò)2ml，輕輕上下?lián)u動(dòng)混勻。筆者認(rèn)為，此種方法適合少量制備紅細(xì)胞懸液，操作簡(jiǎn)單方便，若大量制備則需要多個(gè)抗凝管，反而增加了操作難度。

2.3 玻璃球抗凝處理

將預(yù)計(jì)采血量10 倍的0.9%生理鹽水或PBS 置于玻璃三角錐形瓶中，加入洗滌干凈的實(shí)心透明玻璃珠，以鋪滿瓶底為宜。采集雞血后，沿瓶壁緩緩注入三角瓶，同時(shí)朝一個(gè)方向快速輕輕搖動(dòng)，搖動(dòng)5～10min，直至溶液表面出現(xiàn)泡沫，血液中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，完成抗凝處理。

3 洗滌紅細(xì)胞

為避免試驗(yàn)誤差，洗滌紅細(xì)胞所用的溶液應(yīng)與后續(xù)開(kāi)展血凝和血凝抑制試驗(yàn)所用的溶液一致。即使用0.9%生理鹽水洗滌紅細(xì)胞，則HI 和HA 試驗(yàn)也需要用0.9%生理鹽水；使用PBS洗滌紅細(xì)胞，HI 和HA 試驗(yàn)也要用PBS。

將抗凝處理后的血液移至離心管中進(jìn)行離心。離心要求2000 轉(zhuǎn)/min，每次離心5min，離心2～3 次，具體以離心后上清呈無(wú)色透明為準(zhǔn)。每次離心后，用移液器棄去上清及白細(xì)胞，可將多個(gè)離心管中的紅細(xì)胞向一個(gè)離心管中合并，便于最后準(zhǔn)確吸取紅細(xì)胞。每次洗滌重新加入洗滌液后，可用拇指墊一次性塑料薄膜輕輕上下顛倒混勻，保證充分洗滌。切忌劇烈搖晃，易導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂。洗滌2～3 次后，若上清清亮，可最后一次離心7min，去掉上清，準(zhǔn)確量取紅細(xì)胞制備懸液。

4 制備1%紅細(xì)胞懸液

為便于操作，可將提前量好99ml 生理鹽水或PBS 加入準(zhǔn)備好的容器中，再用一次性移液器吸取1ml 洗滌好的紅細(xì)胞加入其中。吸去紅細(xì)胞時(shí)要把移液器吸頭插入離心管底部緩慢吸取，避免由于吸取速度過(guò)快導(dǎo)致氣體進(jìn)入，造成誤差。量取的紅細(xì)胞加入溶液后，要將吸頭在溶液中反復(fù)吹吸若干次，將殘留在吸頭內(nèi)壁的紅細(xì)胞洗入溶液。若紅細(xì)胞量不足1ml，則按照比例量取溶液配制。

5 保存

將配制完成的紅細(xì)胞懸液置4℃冰箱保存，可放置一周，但根據(jù)筆者臨床經(jīng)驗(yàn)，最好3d 內(nèi)使用完。為避免反復(fù)使用造成污染，可分裝成小份保存，每次試驗(yàn)取出一份使用。