劉東海，張學江，王 鵬，胡 誠，喬 艷，張 智，李雙來

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院植保土肥研究所，武漢 430064；2.棗陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，湖北 棗陽 441200）

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中極其重要的組分［1］，通過參與有機質(zhì)的降解、腐殖質(zhì)的形成和土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化循環(huán)等途徑維持土壤肥力和作物生產(chǎn)力，是反映土壤環(huán)境的重要敏感指標［2，3］，同時土壤微生物的數(shù)量和活性與植物發(fā)病率有密切的關(guān)系［4］。小麥（Triticum aestivumL.）根腐病是重要的土傳真菌病害，在世界各地廣泛分布，在小麥整個生育期都可發(fā)生根腐病害。該病害由麥根腐平臍蠕孢（Bipolaris sorokiniana）［5，6］、鐮刀菌（Fusariumspp.）［7，8］等多種土壤病原菌單獨或復合侵染引起，嚴重影響小麥生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)［9］。在澳大利亞［10］、美國西北太平洋地區(qū)［11，12］，黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是當?shù)匦←湼〉闹饕≡?；中國黃淮麥區(qū)、西北地區(qū)根腐病的優(yōu)勢致病菌是根腐平臍蠕孢菌［13-15］。施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要措施之一，長期施肥可改變土壤理化性質(zhì)和生物活性，影響作物產(chǎn)量［16］以及土壤養(yǎng)分微生物生物量及功能多樣性［17，18］；施肥也影響麥類根腐病害的發(fā)生，劉歡歡等［19］指出生態(tài)炭肥對小麥根腐病的防效及對土壤健康修復作用存在正劑量效應。劉蘋等［20］指出復合生物有機肥和微生物菌有機肥能有效提高土壤中性磷酸酶活性，促進磷素循環(huán)，增強拮抗和有益微生物對禾谷鐮孢菌的抗性并促進小麥生長。因此，本試驗設置不同施肥處理來研究施肥對小麥根際土壤真菌微生物多樣性及根腐病的影響，旨在為小麥根腐病的田間管理提供切實可行的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

2018—2019年在湖北省棗陽市南城辦事處后湖村（E112°42′01″，N31°59′41″）開展2季不同施肥影響根腐病害的試驗。土壤類型為潴育型水稻土，白散泥田。前茬作物為水稻。土壤有機質(zhì)含量為23.34 g/kg，有效磷含量為11.21 mg/kg、速效鉀含量為92.91 mg/kg，pH 5.49。小麥生育期內(nèi)大于10℃的有效積溫為1 914.2℃；降雨量為219.4 mm；最低氣溫為-5.9℃；日照時數(shù)為853.1 h。小麥生育期早期陰雨，后期干旱。供試小麥品種為鄂麥580。

1.2 試驗設計

試驗共設4個處理，分別為不施肥（T1）、習慣施肥（T2）、推薦施肥（T3）和有機肥替代50%化肥（T4）處理。重復3次，小區(qū)面積105 m2，隨機排列。習慣施肥施肥量N為195 kg/hm2，P2O5為67.5 kg/hm2，K2O為60 kg/hm2。推薦施肥和有機肥替代化肥處理施肥量N為150 kg/hm2，P2O5為60 kg/hm2，K2O為5 kg/hm2。供試肥料氮肥為尿素（N，46%），磷肥為過磷酸鈣（P2O5，12%），鉀肥為氯化鉀（K2O，60%）；商品有機肥（湖北雙港農(nóng)業(yè)科技貿(mào)易股份有限公司），養(yǎng)分含量N、P2O5、K2O分別為3.57%、3.38%、3.92%。

10月20日機械條播，行寬27 cm，播種量225 kg/hm2。10月28日灌水抗旱，12月8日化學除草，3月6日防治麥園蜘蛛和蚜蟲，3月27日破口抽穗，4月6日齊穗，4月11日每公頃用戊唑·多菌靈懸浮劑1 500 mL對水375 kg防治小麥赤霉病，4月23日用艾美樂防治穗蚜，5月26日成熟收割。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 于2019年小麥收獲后進行土壤樣品采集，采樣深度為0～20 cm，每個小區(qū)按梅花型5點采樣，剔除石礫和植物殘根等雜物后混合，每個小區(qū)的混合土樣分為兩部分，一部分用于化學指標測試，另一部分放置于-80℃冰箱保存，用于DNA提取和高通量測序。

1.3.2 土壤理化性狀分析 堿解氮含量采用堿解擴散法測定，速效磷含量采用紫外可見分光光度法測定，速效鉀含量采用火焰光度法測定，有機碳含量采用重鉻酸鉀法測定，土壤pH采用1∶2.5的水土比、復合電極測定［21］。

1.3.3 小麥根腐病調(diào)查 小麥收獲期進行根腐病調(diào)查，采用五點取樣法，每點20株，調(diào)查病害的發(fā)病情況，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%；病情指數(shù)=Σ（各級發(fā)病數(shù)級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級別代表值）×100%。小麥成熟期根腐病分級標準參照胡艷峰［13］的方法劃分：0級，根莖基本無癥狀；1級，根莖基部有褐色小病斑；2級，根莖基部有梭形病斑；3級，根莖基部梭形病斑延伸擴展或腐爛；4級，根莖基部嚴重腐爛，植株枯萎。

1.3.4 土壤DNA的提取及MiSeq sequencing測序?qū)Σ煌幚硗寥罉悠凡捎肊.Z.N.A?Soil NDA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提 取 土 壤 總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。對18S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)片段進行PCR擴增，引物序列為SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和81196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）。擴增條件：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán)；72℃延伸5 min。每個樣本3個重復，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor TM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求進行相應比例的混合。在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina MiSeq PE 250平臺分別進行真菌的測序。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Office Excel 2007和SPSS 20.0軟件的Tukey法對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥下土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的表征

2.1.1 高通量測序結(jié)果及α多樣性指數(shù) 從圖1可以看出，稀釋曲線都趨向平緩，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物多樣性信息。12個樣本共得到真菌539 137個有效序列，平均長度為401.68 bp；所有樣本按照最小樣本序列數(shù)（31 751 reads）進行抽平處理，然后按照97%相似度劃分，共得到1域12界33門57綱79目94科102屬145種248 OTUs。

圖1 真菌稀釋曲線

從表1可以看出，不同施肥處理真菌群落豐富度指數(shù)從大到小依次為T4、T1、T2、T3，Shannon多樣性指數(shù)從大到小依次為T1、T2、T4、T3，但2個指標各處理間無顯著差異；各處理真菌群落的覆蓋度為99.91%～99.92%。由此可知，施化肥在一定程度上降低了真菌的豐富度和多樣性指數(shù)，施用有機肥增加了真菌的豐富度指數(shù)。

表1 不同施肥處理的土壤真菌α-多樣性指數(shù)

2.1.2 不同施肥處理下真菌門水平群落結(jié)構(gòu) 土壤真菌門水平群落相對豐度如圖2a所示。不同施肥導致土壤真菌群落結(jié)構(gòu)聚為3類，T3和T4聚為一類；T2聚為一類；T1單獨一類（圖2b）。真菌（門水平）群落組成主要是子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota），二者占到群落組成的92.57%～94.55%。其中，子囊菌門在T2處理中的相對豐度最高（85.48%），顯著高于T4和T1處理；擔子菌門在T1處理的相對豐度最高（21.29%），顯著高于T2和T3處理。與有機肥替代50%化肥的T4處理相比，習慣施肥的T2處理顯著提高了子囊菌門的相對豐度，但降低了擔子菌門的相對豐度。

2.2 不同施肥處理對土壤理化性質(zhì)、根系活力和產(chǎn)量的影響

圖2 不同施肥處理對門水平真菌相對豐度的影響（a）及聚類分析（b）

不同施肥處理對土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生了一定影響，具體見表2。與不施肥處理相比，所有施肥處理土壤pH均有所下降，下降幅度為0.21～0.44個單位，其中習慣施肥處理下降幅度最大，有機肥替代50%化肥處理下降幅度最小。推薦施肥有利于提高土壤堿解氮、速效磷、速效鉀和有機碳含量。小麥根系活力從大到小依次為T4、T3、T2、T1。T2和T3處理的產(chǎn)量分別為5 945.40 kg/hm2和5 878.95 kg/hm2，差異不顯著；T4處理產(chǎn)量為4 767.15 kg/hm2，顯著低于T2和T3，可能是由于當季有效養(yǎng)分不足導致的減產(chǎn)；T1產(chǎn)量最低，為2 402.70 kg/hm2。

表2 不同施肥處理的土壤理化性質(zhì)及產(chǎn)量

2.3 土壤真菌種水平菌群結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子分析

土壤真菌種水平群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子分析如圖3所示。pH和速效鉀聚為一類，有機碳（SOC）和堿解氮聚為一類，速效磷聚為一類。小麥根腐病的致病菌麥根腐平臍蠕孢和禾谷鐮刀菌與環(huán)境因子的相關(guān)性如表3所示。小麥根腐病的致病菌麥根腐平臍蠕孢與土壤堿解氮、速效磷和有機碳含量呈正相關(guān)，與速效鉀含量和pH呈負相關(guān)，但不顯著；致病菌禾谷鐮刀菌與土壤pH和速效磷含量呈正相關(guān)，與土壤有機碳、堿解氮和速效鉀含量呈負相關(guān)，相關(guān)性也不顯著。這可能由于稻麥輪作下，減弱了小麥根腐病致病菌與環(huán)境因子間的相關(guān)性。

圖3 真菌種水平群落環(huán)境因子分析

表3 根腐病致病菌相對豐度與環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)

2.4 不同施肥處理對小麥根腐病菌及其病情指數(shù)的影響

由表4和圖4可知，不同施肥處理下的禾谷鐮刀菌和麥根腐平臍蠕孢的相對豐度不同，各施肥處理禾谷鐮刀菌的相對豐度由高到低依次為T2、T4、T3、T1，麥根腐平臍蠕孢的豐度依次為T3、T1、T4、T2。不同施肥處理的根腐病病情指數(shù)從大到小依次為T1、T2、T3、T4。

表4 不同施肥處理對根腐病致病菌及其病情指數(shù)的影響

圖4 不同施肥處理對真菌種水平相對豐度的影響

3 小結(jié)與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，施用化肥可降低真菌的豐富度和多樣性，與張宇亭［22］研究的結(jié)論一致，主要原因為長期施用化肥造成了酸性和中性土壤pH的降低。有機肥替代50%的化肥可增加真菌的豐富度指數(shù)，比推薦施肥處理多樣性指數(shù)高，可能因為有機和無機肥配施可提高微生物群落多樣性［23］。因此細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性水平等指標可間接地指示土壤肥力及致病能力［24］。

長期不同施肥可以改變真菌群落結(jié)構(gòu)［25，26］。本研究不同施肥量條件下的土壤真菌群落可聚為3類，其中T3和T4聚為一類，T2聚為一類，T1單獨一類。施化肥比有機肥替代更能提高子囊菌門的相對豐度，但降低了擔子菌門的相對豐度，即施有機肥可提高微生物群落多樣性。

不同施肥對土壤基礎化學性質(zhì)產(chǎn)生了不同影響。施用化肥處理降低了土壤pH，施用有機肥減緩了pH的下降，與Zhang等［27］的研究結(jié)果一致。有機肥替代50%化肥處理的產(chǎn)量低于推薦施肥和習慣施肥處理。歐楊虹［28］指出低量有機肥氮（25%）替代化肥氮處理的子粒產(chǎn)量與單施化肥氮相當，只有合適比例的有機肥氮部分替代化肥氮施用才能維持高產(chǎn)。李靜［29］指出50%NPK+6 000 kg/hm2豬糞處理的產(chǎn)量比單施化肥高，且豬糞的養(yǎng)分含量高于50%NPK才能保障產(chǎn)量。

小麥根腐病已成為世界許多小麥種植區(qū)的主要病害之一。根腐病的發(fā)病程度與土壤施肥情況有關(guān)，F(xiàn)ernandez等［30］和Tinline等［31］發(fā)現(xiàn)在低氮情況下，根腐病的發(fā)病情況明顯減輕，與低氮條件下土壤中鐮刀菌的減少有關(guān)。本研究不同施肥條件下禾谷鐮刀菌在真菌群落中的相對豐度跟施肥量多少相關(guān)，從大到小依次為T2、T4、T3、T1，但是與根腐病病情指數(shù)并不相符，這是因為根腐病是由復合侵染引起的。T4處理的根腐病指數(shù)最低，說明施用有機肥能夠降低根腐病發(fā)病率，與文獻報道有機肥可降低病原菌的相對豐度，進而對土壤致病菌有明顯抑制作 用［26，32，33］結(jié) 論 一 致?？?能 因 為：有 機 肥 中 的 木霉［34］、枯草芽孢桿菌［35］和放線菌［36］可以抑制致病菌；有機肥中的有機質(zhì)成分除可通過改善土壤結(jié)構(gòu)修復土壤肥力外，還可以有效地控制土傳細菌及真菌病害［37，38］。因此，施用有機肥有利于小麥根腐病的防治。