王 睿，張冬冬，郭 鵬，王 軼，章春芳，陳 磊，1b

（1.浙江大學(xué)，a.海洋學(xué)院；b.舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316021；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，武漢 430064）

伴隨著工業(yè)和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的快速發(fā)展，廢棄物處理不當(dāng)、化肥農(nóng)藥使用過度導(dǎo)致的環(huán)境問題成為人們關(guān)注的話題，持續(xù)影響著人類的生活［1，2］。在諸多污染物當(dāng)中，含氮化合物被視為主要的一類［3］，其中又以人工養(yǎng)殖尾水中含NH4+-N的化合物為主，特別是來自厭氧消化液和肥料處理工廠的高濃度NH4+-N廢水［4，5］。水中過量的NH4+-N可能會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化或者被飲用后對人體健康造成傷害。因此，去除污水中過量的氨氮十分必要。

在傳統(tǒng)的生物脫氮過程中，NH4+-N首先通過好氧的硝化反應(yīng)被氧化為NO3--N，再通過厭氧的反硝化反應(yīng)被還原為N2［6］。然而，該過程的反硝化反應(yīng)階段需要額外添加碳源，會增加處理成本，并且可能造成二次污染。因此，這種傳統(tǒng)的硝化-反硝化過程難以處理低碳氮比或者不含外加碳源的養(yǎng)殖尾水。另一種方式為厭氧氨氧化，這是一個自發(fā)的反應(yīng)過程，可以同時去除NH4+-N和NO2--N，然而由于厭氧氨氧化細(xì)菌難以富集培養(yǎng)［7］，很難被廣泛地應(yīng)用。

近年來，生物電化學(xué)系統(tǒng)已被認(rèn)為是能同時實現(xiàn)硝化和反硝化作用的可行技術(shù)［8-10］。這些生物電化學(xué)系統(tǒng)的關(guān)鍵特點在于，使用固態(tài)電極作為電子供體或受體，通過電子直接轉(zhuǎn)移或以電子媒介體和氫氣為介導(dǎo)來驅(qū)動微生物的反應(yīng)。例如，Virdis等［8］發(fā)現(xiàn)在一個以固態(tài)電極為電子供體的微生物燃料電池中存在同步的硝化和反硝化反應(yīng)，然而很難將這個系統(tǒng)應(yīng)用于處理低碳氮比的養(yǎng)殖尾水中。Zhan等［10］用微生物電解槽實現(xiàn)了硝化和反硝化作用，在這個電解槽中，陰極和陽極分別用來富集反硝化和硝化細(xì)菌，從而進(jìn)行反硝化和硝化反應(yīng)。為了獲得更好的效能，大多數(shù)研究人員會用電壓高于1.8 V［11，12］的電刺激進(jìn)行試驗，但Zhan等［10］發(fā)現(xiàn)當(dāng)外加電壓為0.2 V時已足夠催化反應(yīng)的進(jìn)行。

在上述研究中使用的電極材料（例如碳?xì)帧⑻疾迹┯捎诔杀靖撸?3］，因而在大規(guī)模應(yīng)用上面臨巨大挑戰(zhàn)［13］，例如它們無法長距離傳輸電子（碳缺乏金屬的導(dǎo)電性）［14］。據(jù)報道，電極材料的成本占生物電化學(xué)系統(tǒng)（BES）總成本的20%～50%［13，15，16］。因此，降低電極的制造成本對于促進(jìn)BES技術(shù)的商業(yè)化至關(guān)重要。盡管已有研究建議利用生物碳作為BES陽極或陰極的低成本、可持續(xù)的電極材料［15，17］，然而生物碳相對較低的電導(dǎo)率成為實際應(yīng)用中新的問題［18］?；钚蕴迹ˋC）被認(rèn)為是一種廉價而有效的電極材料［19］，比表面積為1 000～2 000 m2/g［20］，孔隙率高于其他碳基電極材料［21］。活性碳電極可以通過滾壓法將其固定于不銹鋼網(wǎng)上制作而成，這種壓制活性碳板（ACP）電極具有成本低、可重復(fù)性和可擴展性高［22，23］等顯著優(yōu)勢，其通過增強電子和離子的轉(zhuǎn)移及促進(jìn)電極表面生物膜的生長［19］，從而提高電極的表現(xiàn)性能。

然而，現(xiàn)有相關(guān)研究大多集中在陰極上，關(guān)于使用ACP作為BES的陽極知之甚少。此外，迄今為止相關(guān)研究主要集中在產(chǎn)電方面，而基于ACP的BES中有關(guān)廢水處理的報道很少，且ACP電極尚未在BES中用于同時硝化和反硝化反應(yīng)。因此，本研究的主要目的是探究BES中采用人工制造ACP陽極和陰極對含NH4+-N廢水進(jìn)行降解處理的可行性與效果。此外還對ACP電極表面生物膜微生物群落進(jìn)行了分析，以了解反應(yīng)器中硝化功能菌和反硝化功能菌的組成與多樣性。

1 材料與方法

1.1 ACP電極的制作

ACP電極由超電容活性碳粉末（1 500 m2/g，中國福建新森碳素有限公司）、炭黑粉末和聚四氟乙烯（PTFE）組成，并以不銹鋼網(wǎng)為基質(zhì)，通過改進(jìn)的平板壓制方法制備［24］。具體方法為先將4.0 g活性碳粉和0.4 g碳黑粉在燒杯中與適量的2-丙醇混合，并在30℃下超聲攪拌30 min，然后將7.3 g 10%（m/V）PTFE懸浮液慢慢滴入其中。再經(jīng)過30 min的超聲處理后，將混合物攪拌并在60℃下干燥，得到面團狀的糊狀物。將該糊狀物分為2份，平壓成2個薄膜（每個厚度為0.8 mm），然后壓在不銹鋼網(wǎng)的兩側(cè)，以形成0.4 mm厚度的平板，隨后將該平板置于340℃高溫下25 min，獲得0.8 mm厚度的ACP電極。在使用之前，將ACP薄片切成長10 cm、寬5 cm的矩形。

1.2 構(gòu)建反應(yīng)系統(tǒng)

圖1為本研究中使用的BES結(jié)構(gòu)（由有機玻璃制成）的詳細(xì)示意。將2個ACP電極放入BES中并連接到直流電源，BES的有效體積為1 L，在反應(yīng)器底部設(shè)置一個采樣口。將活性污泥（來源于新洲污水處理廠）接種于反應(yīng)器以加速反應(yīng)系統(tǒng)的啟動，并外加0.1 V的電壓刺激，初始NH4+-N濃度為200 mg/L。富集培養(yǎng)基的成分為0.4 g NaH2PO4、0.6 g Na2HPO4·12H2O、0.2 g NaCl、1.6 g NaHCO3、0.02 g CaCl2·H2O和0.05 g MgSO4·7H2O。開始試驗后，BES將在室溫下以分批次進(jìn)料的模式穩(wěn)定運行至少30 d，直至NH4+-N去除率達(dá)90%。

圖1 BES結(jié)構(gòu)

1.3 電能對BES脫氮效果的影響

分別在0.25、0.15、0.10、0 V外加電壓下運行BES，研究電能對NH4+-N去除性能的影響。反應(yīng)器在室溫下以批次進(jìn)料模式運行，初始NH4+-N含量為200 mg/L，初始pH預(yù)先調(diào)整為7.0，其他試驗條件與反應(yīng)器啟動階段相同。為評估BES中直接電化學(xué)作用對NH4+-N去除的貢獻(xiàn)，研究還進(jìn)行了非生物對照試驗。每天采集液體樣品，通過配備有SI-90 4E色譜柱和電導(dǎo)檢測器的Metrohm 761離子色譜儀（Herisau，瑞士）測定NO3--N和NO2--N的濃度。NH4+-N濃度采用Nessler法，通過紫外可見分光光度計（Hach Loveland，DR-2800，美國）進(jìn)行測定。所有試驗均重復(fù)3次，采用單因素方差分析（ANOVA）評估結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)差異顯著性（P=0.05）。

1.4 NH4+-N初始濃度對BES脫氮效果的影響

在外加電壓為0.15 V的條件下，分別設(shè)置初始NH4+-N濃度為150、250、300 mg/L，其他參數(shù)保持不變，研究初始NH4+-N濃度對BES脫氮效果的影響。依據(jù)其他類似研究使用的養(yǎng)殖尾水或人工合成廢水中的NH4+-N濃度［5，25-29］，來設(shè)置本研究中NH4+-N的初始濃度，每天測定BES中NH4+-N、NO3--N和NO2--N的濃度，所有試驗均重復(fù)3次。

1.5 循環(huán)伏安法（CV）測量

批次試驗完成后，將帶有生物膜的ACP陽極和陰極從反應(yīng)器中取出，分別放入2個新的電解池中，在厭氧條件下進(jìn)行CV測量。CV測量用恒電位儀（WMPG1000K8型，WonATech，韓國首爾），所用電極為Ag/AgCl參比電極（HX-R8型，Hokuto Denko Inc，日本大阪），電位范圍為-0.8～0.6 V，用于CV測量的電解質(zhì)成分為25 mmol/L磷酸鹽緩沖液（4.58 g/L Na2HPO4和2.45 g/L NaH2PO4·H2O；0.13 g/L KCl，pH 7.0）。

1.6 生物膜樣品的焦磷酸測序

試驗結(jié)束后，在手套箱（英國Electrotek，AW300SG）中收集ACP陽極和陰極表面的生物膜樣品，用Power Soil DNA提取試劑盒（美國Mobio）從1 mL生物膜樣品中提取基因組DNA，用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒檢測DNA的質(zhì)量和濃度，用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）擴增細(xì)菌16S rRNA片段的V3-V4區(qū)，隨后通過生工生物工程公司（中國上海）Illumina Mi Seq PE300測序平臺進(jìn)行高通量測序和分析［30］，最后使用Mothur程序計算微生物群落Alpha多樣性參數(shù)，包括Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Good’s coverage和Simpson指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 電能對BES中NH4+-N、NO2--N和NO3--N去除的影響

設(shè)定初始NH4+-N濃度為200 mg/L，BES閉路系統(tǒng)的NH4+-N去除率在4 d后接近98%，與開路系統(tǒng)相比展現(xiàn)了更高的NH4+-N去除效率（圖2a）。此外，處理4 d后在開路系統(tǒng)中累積了大約20.5 mg/L NO2--N和36.5 mg/L NO3--N，但是在施加電能的系統(tǒng)中2個指標(biāo)的殘留量大大降低，尤其是在較高電壓（0.15、0.25 V）閉路系統(tǒng)中幾乎沒有殘留（圖2b、圖2c），表明通過施加電能可以提高BES的脫氮能力。在非生物試驗中并未觀察到NH4+-N降低（數(shù)據(jù)未展示），表明NH4+-N去除率的增強可歸因于微生物代謝活動的提高。在本研究中，平均NH4+-N去除量為47.8 mg/（L·d），與在無有機碳條件下的脫氮速率31～60 mg/（L·d）相當(dāng)［10，31］。但值得指出的是，與之前使用碳?xì)值难芯肯啾?，本研究中使用的ACP電極具有更低的價格與更好的可重復(fù)性［10，31］。

2.2 初始NH4+-N濃度對BES脫氮效果的影響

在控制外部電壓為0.15 V的前提下，依次將NH4+-N初始濃度設(shè)置為150、250、300 mg/L，研究初始NH4+-N濃度對脫氮效率的影響（圖3）。如圖3a所示，當(dāng)系統(tǒng)中NH4+-N的初始濃度為150 mg/L時，處理4 d后NH4+-N、NO2--N和NO3--N可以完全去除。同樣，當(dāng)NH4+-N初始濃度為200 mg/L時，也可以在0.15 V外加電壓下被去除，幾乎沒有殘留物（圖2）。但是，當(dāng)NH4+-N初始濃度增加至250 mg/L或300 mg/L時，NH4+-N降解效果下降，并出現(xiàn)明顯積累，積累濃度分別達(dá)92 mg/L和32 mg/L；同時，NO2--N和NO3--N也開始在系統(tǒng)中積累（圖3b、圖3c），特別是在NH4+-N初始濃度為300 mg/L的系統(tǒng)中，分別累積了24.5 mg/L NO2--N和52.2 mg/L NO3--N。在之前研究中，Zhan等［10］也觀察到了與此類似的趨勢，當(dāng)向系統(tǒng)中添加濃度為150 mg/L的NH4+-N時，NO3--N開始出現(xiàn)積累。

圖2 不同外加電壓下BES中NH4+-N（a）、NO2--N（b）和NO3--N（c）的濃度變化

圖3 不同初始NH4+-N濃度下BES中NH4+-N（a）、NO2--N（b）和NO3--N（c）的濃度變化

2.3 CV測量結(jié)果

微生物經(jīng)培養(yǎng)富集后，生物陽極相比于裸電極（0.024 mA）在0.6 V下顯示了更高的陽極催化電流（1.3 mA），同樣生物陰極相比于裸電極（-3.6 mA）在-0.8 V下也顯示了更高的陰極催化電流（-1.4 mA）（圖4），這可能是由于ACP電極表面形成生物膜后導(dǎo)致其電容變大和電阻變小所致［32，33］。在陽極生物膜的循環(huán)伏安圖上，氧化和還原波峰分別出現(xiàn)在0.25 V和0.23 V，并且這2個峰的氧化還原電位低于之前研究中氨氧化生物陽極的氧化還原電位［31］，這可能是由于本研究中生物膜微生物群落組成和功能菌與以往不同。另外，生物陰極的循環(huán)伏安圖上出現(xiàn)了多個氧化和還原波峰，雖然這些峰并不明顯，但也表明在陰極表面上存在著多種具有不同氧化還原電勢的氧化還原活性成分［34］。

圖4 生物膜陽極和陰極的CV結(jié)果

陽極CV中產(chǎn)生的電流與陰極CV中產(chǎn)生的電流相似，表明生物陽極和生物陰極反應(yīng)在BES中均占主導(dǎo)地位［35］。生物陽極和生物陰極的CV形狀不明顯的差異可能是由于它們具有相同的微生物來源（活性污泥），并且具有多種相似的功能菌種，這些微生物同時具備硝化與反硝化的能力［36］。此外，在陰、陽兩極生物膜中存在的電化學(xué)活性微生物或其生物膜中氧化還原活性組分也可能是相似的，很多硝酸鹽還原菌具有雙向電子轉(zhuǎn)移的能力，如Geobacter和Pseudomonas［37］，生物陽極和生物陰極發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的具體機理還有待進(jìn)一步研究。

2.4 陽極和陰極生物膜微生物群落分析

使用高通量測序確定了原始活性污泥以及陽極和陰極生物膜微生物群落組成，并統(tǒng)計了Good’s coverage、OTU數(shù)、Shannon指數(shù)、Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)（表1）。由表1可知，Good’s coverage為0.96～0.98，表明已對樣品中大多數(shù)微生物群落進(jìn)行了測序；Shannon指數(shù)表明，相對于原始活性污泥，陽極和陰極生物膜微生物多樣性更為豐富，這可能是因為在適應(yīng)了BES的環(huán)境后，更多參與脫氮反應(yīng)電子轉(zhuǎn)移的菌種得以富集，這也符合之前研究報道的結(jié)果［31］；陽極和陰極生物膜的Ace和Chao1指數(shù)較低，表明總微生物豐度低于原始活性污泥的微生物豐度。

表1 樣品序列讀取數(shù)和Alpha多樣性參數(shù)

由圖5可知，最初的活性污泥中鑒定出的主要菌屬為溶菌桿菌屬（Lysinibacillus，45.42%）、短桿菌屬（Brevibacillus，16.30%）、芽孢桿 菌屬（Bacillus，13.34%）、嗜堿菌屬（Alkaliphilus，7.55%）、提氏菌屬（Tissierella，2.90%）和副球菌屬（Par acoccus，2.60%）。由此可見，原來的污泥中已經(jīng)有一些硝化菌和反硝化菌［38-42］。其中，研究表明溶菌桿菌屬、芽孢桿菌屬和副球菌屬中存在能夠有效地同時進(jìn)行異養(yǎng)硝化和好氧反硝化反應(yīng)的菌種［38-40］，而短桿菌屬作為革蘭氏陽性反硝化細(xì)菌，廣泛分布于環(huán)境當(dāng)中［41］。另有報道表明，向培養(yǎng)基中添加硝酸鹽后，提氏菌屬的生長會增強，可能參與到硝酸鹽的還原過程［42］。

圖5 生物膜組分的微生物群落分析

經(jīng)BES富集、培養(yǎng)后，副球菌屬（15.86%）在陽極生物膜，即硝化反應(yīng)端生長量非常明顯，而假單胞菌屬（Ps eud omonas，14.90%）作為新出現(xiàn)的反硝化功能菌，成為陰極生物膜中進(jìn)行反硝化作用的優(yōu)勢細(xì)菌。關(guān)于假單胞菌，現(xiàn)已有詳細(xì)研究報道其在厭氧條件下具有高效的反硝化作用［41，43］。這表明副球菌屬和假單胞菌屬可能在該BES中的陽極硝化端和陰極反硝化端中起到最主要作用，該結(jié)果也與Zhan等［31］的研究結(jié)果相一致。

該系統(tǒng)陽極生物膜上還富集有其他硝化菌，例如能夠進(jìn)行異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的叢毛單胞菌屬（Comamonas，12.24%）和 紅 細(xì) 菌 屬（Rhodobacter，4.04%）［44，45］，可以通過異養(yǎng)或自養(yǎng)硝化作用參與氨氧化的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，4.82%）和在部分硝化過程中能進(jìn)行氨氧化的食酸菌屬（Acidovorax，1.51%）［46，47］。同樣，陰極生物膜上也富集有其他反硝化菌，例如固氮螺菌屬（Azospirillum，10.72%）、固氮弧菌屬（Azoarcus，7.54%）、硫桿菌屬（Thiobacillus，3.13%）和煙桿菌屬（Ignavi bacterium，2.11%）。已有相關(guān)研究對固氮螺菌屬、煙桿菌屬、固氮弧菌屬和硫桿菌屬［48-51］參與反硝化作用進(jìn)行了詳盡的報道。由于外部施加電能，促進(jìn)了上述這些硝化菌和反硝化菌的生長繁殖，它們同樣也可能參與了BES中的硝化和反硝化過程。

電化學(xué)活性微生物是指能夠通過直接的胞外電子傳遞或通過氧化還原活性成分向固態(tài)電極傳遞或得到電子的菌群［52，53］。在陰極生物膜上的反硝化菌群中，假單胞菌屬［54］和硫桿菌屬［55］曾被報道具有電活性。Su等［54］已經(jīng)證明，假單胞菌屬中P.alcaliphilaMBR菌株可以利用電極作為電子供體從而增強硝酸鹽還原反應(yīng)。因此，在本研究中假單胞菌屬和硫桿菌屬在陰極生物膜的反硝化過程中可能起到重要的作用。此外，Kato等［55］揭示了地桿菌屬（Geobacter）中G.sulfurreducens和硫桿菌屬（Thiobacillus）中T.denitrificans通過導(dǎo)電礦物質(zhì)介導(dǎo)的菌間電子傳遞以實現(xiàn)硝酸鹽的還原反應(yīng)。地桿菌屬細(xì)菌在本研究的陽極生物膜中被檢測到，雖然僅占細(xì)菌總數(shù)的1.15%，但已有大量文獻(xiàn)對其電化學(xué)活性進(jìn)行了報道［56-58］。并且之前已有研究表明，通過硝化和反硝化過程進(jìn)行的脫氮反應(yīng)的BES的陽極隔室中存在地桿菌屬細(xì)菌［53］，這與本研究結(jié)果相吻合。地桿菌屬細(xì)菌作為硝化菌尚未被報道，其可能并未直接參與硝化反應(yīng)，而是與其他硝化功能菌協(xié)同發(fā)揮作用實現(xiàn)氨氮氧化反應(yīng)。本研究無法確定陽極和陰極生物膜之間相對復(fù)雜的微生物群落電子轉(zhuǎn)移機理，之后需要進(jìn)一步對電化學(xué)活性微生物、硝化菌和反硝化菌之間的協(xié)同作用和相互關(guān)系進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，以人工制備的活性碳板為電極的BES提高了NH4+-N的去除率。ACP電極表現(xiàn)出很強的電化學(xué)效應(yīng)，并通過增加外加電壓可提高NH4+-N的去除效率，可以達(dá)到與使用碳?xì)蛛姌O的BES相當(dāng)?shù)娜コЧ?。生物膜群落分析表明，在ACP電極表面存在多種硝化與反硝化細(xì)菌和電化學(xué)活性微生物。該研究結(jié)果證明了通過將低成本電極應(yīng)用于BES中實現(xiàn)高效的電催化微生物反應(yīng)是可行的，且具有很高的應(yīng)用開發(fā)潛力。