（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、植物活體分泌物或昆蟲(chóng)排泄物，帶回巢房中貯存，并加入自身特殊的分泌物，進(jìn)行轉(zhuǎn)化、脫水至成熟的天然甜物質(zhì)[1]，是人類早期非常重要的能量來(lái)源之一。荊條蜜作為我國(guó)四大名蜜之一，在我國(guó)被列為一等蜜，產(chǎn)量大而且穩(wěn)定，是每年穩(wěn)定收入的蜂蜜品種。荊條蜜也叫荊花蜜，其蜜源植物為落葉灌木荊條（也叫荊子），該植物耐貧瘠，耐旱且花期較長(zhǎng)，主要分布于我國(guó)華北和東北南部地區(qū)。荊條蜜呈淺琥珀色，易結(jié)晶，結(jié)晶后呈細(xì)膩白色，氣味清香，口感甜潤(rùn)[2]。

蜂蜜作為天然保健品，富含有機(jī)酸、礦物質(zhì)、維生素、酚類等天然活性物質(zhì)，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，蜂蜜具有調(diào)節(jié)胃腸道、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、調(diào)節(jié)血糖平衡、抗炎等多種功能活性[3-5]。其中多酚類物質(zhì)作為蜂蜜中一類非常重要的化合物，與蜂蜜的大多數(shù)功能活性有關(guān)[6-8]。研究表明荊條蜜中的多酚類物質(zhì)具有延緩果蠅衰老[9]、保護(hù)DNA損傷[10]的功效，應(yīng)用價(jià)值顯著。

本研究通過(guò)對(duì)荊條蜜中多酚類成分進(jìn)行定量分析，找出荊條蜜中特征性成分并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，建立荊條蜜的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，為日后商品蜜的真實(shí)性評(píng)價(jià)提供參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

荊條蜜于2018年采自山西省沁水縣。主要試劑包括：標(biāo)品新綠原酸、4-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、p-香豆酸、反，反式脫落酸、順，反式脫落酸、短葉松素；分析純甲醇、甲酸、氨水購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；色譜級(jí)甲醇、乙酸，質(zhì)譜級(jí)乙酸購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；DMSO-d6購(gòu)自Adamas公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Sorvall ST8 ST8R型臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；Strata-X-A固相萃取柱（60mg/3ml）（美國(guó)Phenomenex公司）；無(wú)菌注射器（江蘇正康醫(yī)療器械有限公司）；24孔固相萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）；0.22μm微孔濾膜（Milipore公司）；移液器（美國(guó)Thermo公司）；JC-QXS-4.5L型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超純水系統(tǒng)（Merk Millipore公司）；LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；氮吹儀（冠森生物科技上海公司）；AD-9925型真空泵（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；高效液相色譜儀和6520四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF）（美國(guó)Agilent公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蜂蜜中多酚類化合物的富集

（1）蜂蜜樣品的前處理：準(zhǔn)確稱量蜂蜜樣品20g，用80ml超純水充分溶解，使用氨水調(diào)節(jié)pH =7。

（2）離心去除雜質(zhì)：蜂蜜溶液在9000×g離心15min除去蜂蜜水中的固體不溶物，取離心后的上清液倒入燒杯備用。

（3）固相萃取柱的活化和平衡：用3ml分析級(jí)甲醇對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化，再用5ml水（pH=7）對(duì)固相萃取柱進(jìn)行平衡。

（4）富集蜂蜜溶液中的多酚類化合物，將蜂蜜上清液依次通過(guò)平衡后的固相萃取柱。

（5）多酚類化合物的收集：蜂蜜溶液過(guò)完萃取柱后，用4ml超純水清洗萃取柱，再用3ml甲醇（含10%甲酸）溶液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。

（6）洗脫液用氮?dú)猓ǖ祪x）吹至干燥，隨后用2ml甲醇（色譜級(jí)）進(jìn)行復(fù)溶，再過(guò)0.22μm 微孔濾膜于液相上樣瓶中備用。

1.3.2 蜂蜜樣品的高效液相色譜分析條件

色譜柱：Shim-Pack PREP-ODS（250mm×4.6mm，5μm）；樣品進(jìn)樣量為20μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm；柱溫箱溫度為38℃。流動(dòng)相A：水（含0.1%的甲酸），流動(dòng)相B：甲醇（含0.1%的甲酸），總流速0.7ml/min。

高效液相梯度洗脫程序：0～10min，9%～15%B；10～17min，15% B；17～28min，15%～17% B；28～38min，17%～25% B；38～45min，25%～32% B；45～55min，32%～33% B；55～65min，33%～34%B；65～70min，34%～36% B；70～75min，36% B；75～85min，36%～40% B；85～90min，40%～45% B；90～95min，45%～53% B；95～120min，53%～64% B；120～135min，64%～80% B。

1.3.3 質(zhì)譜分析條件

液相質(zhì)譜（LC-QTOF）分析條件：離子源為ESI源（電噴霧），離子源噴射電壓為4kV，出口電壓為130V，加熱的溫度350℃，氮?dú)猓∟2）流速為11 l/min，碰撞氣體為氦氣，霧化氣流速為80kPa，霧化器的壓力40psi，質(zhì)量掃描范圍m/z=60～900Da。

2 結(jié)果分析

2.1 荊條蜜中特征性成分鑒定

荊條蜜中已經(jīng)鑒定出11種多酚類成分其中包括：新綠原酸、4-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸、短葉松素、反，反脫落酸、松屬素、p-香豆酸、順，反-脫落酸、山奈酚和柯因。但其中較明顯的成分化合物6（圖1）未確定其結(jié)構(gòu)，從荊條蜜的HPLC色譜圖中可以看到，化合物6是荊條蜜的特征性成分，因此我們將它命名為荊條素（Vitexin）并通過(guò)LC-MS對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。

圖1 荊條蜜樣品中多酚類化合物的HPLC圖譜

圖2為荊條蜜在ESI源下的正、負(fù)離子模式的一級(jí)質(zhì)譜圖，從中可以看到正離子模式下651.1914m/z [M+Na]+的分子離子峰；在負(fù)離子模式下可以看到明顯的627.1879m/z [M-H]-分子離子峰，負(fù)離子模式下，表現(xiàn)為產(chǎn)生[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰并且這顯著是多酚類化合物的電離特征，在二級(jí)質(zhì)譜圖（圖3）上主要表現(xiàn)為脫去兩分子六碳糖的質(zhì)譜裂解特征。以脫氧葡萄糖（C6H10O5）的形式脫掉糖苷分別產(chǎn)生離子m/z 465、m/z 303，其中m/z 303、m/z 285表示化合物明顯脫水。結(jié)合脫水和脫糖苷的過(guò)程，分析化合物的分子式為C27H32O17。以M 286為母核的多酚類天然產(chǎn)物主要有以下幾種，結(jié)合以上由m/z 303-＞m/z 285的脫水特征裂解途徑，m/z 285-＞m/z 241為脫CO2的裂解途徑，可以判斷只有產(chǎn)生類木犀草素的離子符合。在負(fù)離子模式下作多級(jí)裂解分析，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)碰撞能量提高，碎片離子m/z 285和m/z 303的強(qiáng)度未有顯著改變，分析可能是由于該離子較為穩(wěn)定，不易碎裂，所以推測(cè)其前體離子是m/z 303或?yàn)門axifolin負(fù)離子。通過(guò)結(jié)合Chemspider和Scifinder對(duì)分子式為C27H32O17并含有兩個(gè)糖苷元的化合物的檢索，只有3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷（圖4）符合。

圖2 正、負(fù)離子模式下化合物11的質(zhì)譜圖

圖3 負(fù)離子模式下化合物6的二級(jí)質(zhì)譜圖（LC-QTOFMSMS）

圖4 3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷

該化合物在正、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜裂解途徑如圖5、圖6所示（低質(zhì)量端主要為糖苷裂解產(chǎn)生），結(jié)果表明化產(chǎn)物中的碎片離子的歸屬得到了合理的解釋。

圖5 3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷負(fù)離子模式下質(zhì)譜裂解途徑（ESI-）

圖6 3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷正離子模式下質(zhì)譜裂解途徑（ESI+）

表1 原料荊條蜜樣品中多酚類化合物含量 (μg/100g)

綜上，通過(guò)質(zhì)譜分析，我們確定了荊條蜜中標(biāo)志性成分—荊條素，其化學(xué)命名為：3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷，英文名為：7-O-β-Dglucopyranosyl-dihydroquercetin-3-O-α-Dglucopyranoside。

2.2 荊條蜜中多酚類成分HPLC-PDA定量

15個(gè)荊條原料蜜樣品中的多酚類成分采用HPLCPDA外標(biāo)法定量，結(jié)果如表1所示。

對(duì)不同產(chǎn)地收集的15個(gè)荊條原料蜜中9種多酚類成分進(jìn)行定量分析，15個(gè)樣品中各成分含量存在差異。所有樣品中荊條素的含量最高，含量范圍為668.48μg/100g～8600.10μg/100g，平均含量為2500.11μg/100g，中位數(shù)為1347.08μg/100g；除樣品V7、V8和V13外，其他樣品中荊條素的含量均大于1000μg/100g。

2.3 荊條蜜多酚類成分指紋圖譜的建立

將不同產(chǎn)地收集的15個(gè)原料荊條蜜的高效液相色譜圖導(dǎo)入到中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中進(jìn)行 分析。對(duì)15個(gè)樣品的色譜峰進(jìn)行匹配和多點(diǎn)矯正，并生成整合的HPLC圖譜（圖8）。選擇具有代表性的4個(gè)峰，模擬生成具有代表意義的荊條蜜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（圖7），計(jì)算15個(gè)原料蜜樣品的相似度。

15個(gè)樣品之間相似度較一致，計(jì)算相似度范圍在0.72～0.93之間，其中樣品V1、V2、V5、V9、V10和V12相似度高于0.9，表明這幾個(gè)樣品與對(duì)照?qǐng)D譜較一致；V3、V4、V6、V11和V14樣品的相似度小于0.8，表明其相似度較低；但整體上樣品的相似度都在0.8左右，因此這15個(gè)原料荊條蜜整體較一致。

圖7 荊條蜜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜 （1～4號(hào)分別為4-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸和荊條素）

圖8 原料荊條蜜樣品生成的HPLC色譜圖

3 結(jié)論

多酚類化合物廣泛存在于植物的根、莖、葉中，與植物的生理功能有重要聯(lián)系[11-13]。多酚類物質(zhì)主要包括酚酸和黃酮兩大類，植物細(xì)胞中的黃酮類化合物常與糖結(jié)合形成苷，以苷類形式存在。蜂蜜中的黃酮類化合物主要來(lái)自于蜜源植物，因此多以糖苷形式存在[14]。研究表明，有些多酚類成分可以作為單花蜂蜜的標(biāo)志性成分，如：向日葵蜂蜜中的槲皮素、麥盧卡蜂蜜中的沒(méi)食子酸、油菜蜜中的綠原酸和鞣花酸等[15]。因此，蜂蜜中多酚類化合物廣泛應(yīng)用于單花蜜溯源和真實(shí)性評(píng)價(jià)。

本研究通過(guò)對(duì)荊條蜜的多酚類成分進(jìn)行分析，首次鑒定出3-O-α-7-O-β-二葡萄糖花旗松素苷，并將其命名為荊條素（Vitexin）。多項(xiàng)研究表明花旗松素-3-O-葡糖苷以及與荊條素有類似結(jié)構(gòu)的黃酮苷類化合物如落新婦苷等，有重要的生物活性功能[16-18]，如抗氧化、抗菌、調(diào)節(jié)免疫力、抑制腫瘤等作用。在收集的所有原料荊條蜜樣品中均含有以下四種成分，分別為4-羥基苯甲酸、綠原酸、咖啡酸和荊條素，其中荊條素的含量最高，目前荊條素只在荊條蜜中發(fā)現(xiàn)，故將其作為荊條蜜的特征性成分。通過(guò)建立的指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，荊條蜜樣品之間有較好的相似度。

蜂蜜備受消費(fèi)者的青睞，但是目前質(zhì)量參差不齊，蜂蜜市場(chǎng)亂象叢生，有大量的摻假蜂蜜流向市場(chǎng)，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，可以比對(duì)出摻假蜂蜜，甚至可以選擇出優(yōu)質(zhì)蜂蜜。本研究對(duì)荊條蜜的特征性成分定性、定量以及建立的指紋圖譜，可為開(kāi)發(fā)蜂蜜功能活性、蜂蜜溯源及商品蜜的真假鑒別提供參考。