施海燕 宋美潔 趙玲玲 齊素貞 吳黎明 薛曉鋒

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2 北京百花蜂業(yè)科技發(fā)展股份公司，北京 100176）

氯霉素是從微生物代謝物中分離的一種廣譜抗生素，目前通過人工合成已廣泛用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療。但是氯霉素有較強(qiáng)的毒副作用，它能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，因此動(dòng)物食品中的氯霉素殘留對(duì)人類健康構(gòu)成了潛在危害[1]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織于1994年決定禁止使用氯霉素，許多國(guó)家禁止此藥用于生產(chǎn)食品動(dòng)物，并規(guī)定了其在畜產(chǎn)品中最高限量。其中，各國(guó)對(duì)蜂蜜中氯霉素的殘留限量作了嚴(yán)格規(guī)定，如美國(guó)0.3μg/kg、日本5μg/kg、加拿大1μg/kg及歐盟0.1μg/kg[2]。我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定氯霉素在蜂蜜中不得檢出。氯霉素殘留檢測(cè)已經(jīng)成為進(jìn)出口蜂產(chǎn)品的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)指標(biāo)[3,4]，保證氯霉素殘留檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠，對(duì)于提高監(jiān)管機(jī)構(gòu)執(zhí)法能力和保障企業(yè)的合法利益具有重要的意義。

基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是分析技術(shù)重要的技術(shù)物質(zhì)保障。加快農(nóng)業(yè)領(lǐng)域基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)，是提高農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新能力、促進(jìn)農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展和增強(qiáng)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的必然要求。基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在保證分析方法的準(zhǔn)確性及可溯源性方面具有重要作用[5]。在日常的檢測(cè)工作中，檢測(cè)人員經(jīng)常通過人為添加藥物到基體中形成一個(gè)“陽(yáng)性”樣品，并通過測(cè)定回收率來評(píng)判方法和檢測(cè)結(jié)果的可靠性。然而，藥物在生物體內(nèi)代謝復(fù)雜，結(jié)合形式多樣，在提取方法、提取溶劑的使用方面同人為添加藥物殘留的檢測(cè)不同，因此，人為添加的樣品不一定真實(shí)反映藥物在基體的實(shí)際情況，不能完全保證檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠[6]。自然基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求其候選材料獲取于天然基體，目標(biāo)物和基體結(jié)合情形與真實(shí)檢測(cè)樣品完全一致，可有效避免基體效應(yīng)對(duì)物質(zhì)成分分析的影響。

我國(guó)已有多種食品分析用基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各類食品的實(shí)驗(yàn)室能力考核、檢測(cè)機(jī)構(gòu)能力比對(duì)、企業(yè)實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制等[7]。但關(guān)于蜂蜜基體標(biāo)物研究較少，僅有蜂蜜中磺胺和羥甲基糠醛的基體標(biāo)物有報(bào)道，目前尚未見蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制報(bào)道。本文以洋槐蜂蜜為基體，通過實(shí)際的蜂場(chǎng)飼喂方式，研制了蜂蜜中的氯霉素殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Aglient 1260液相色譜（美國(guó)Aglient公司）；AglientUltivo Tripe Auad MS 6465B（美國(guó)Aglient公司）；METTLER XS105十萬分之一天平，METTLER AL104萬分之一天平，50ml、25ml棕色容量瓶（均為A級(jí)），10ml棕色容量瓶（B級(jí)），2.0ml單標(biāo)線吸量管（A級(jí)），1000μl可調(diào)移液器（最大允許誤差為1.0%）、100μl可調(diào)移液器（最大允許誤差為2.0%）均已通過北京市計(jì)量檢測(cè)科學(xué)研究院校準(zhǔn)和檢定；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Vortex-Genie 2型渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；BAKERBOND固相萃取儀（美國(guó)Waters公司）；水浴氮吹儀（美國(guó)Organomation公司，N-EVAPTM 111，OA-SYSTM水浴加熱裝置）。

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、氨水（LC-MS級(jí)別，美國(guó)Fisher公司）；甲酸（LC-MS級(jí)別，德國(guó)Sigma公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為經(jīng)Milli-Q凈水系統(tǒng)（0.22μm過濾膜）過濾的去離子水；氯霉素購(gòu)自中國(guó)農(nóng)科院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，為國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，編號(hào)GBW（E）082557，標(biāo)準(zhǔn)值100mg/l，不確定度3mg/l（k=2）；氯霉素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品（D5-氯霉素）純度為100mg/l，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。SPE萃取小柱：Oasis HLB柱（6ml 200mg，美國(guó)Waters公司）。Bond ElutQuEChERS試劑盒（型號(hào)：5982-0032）及QuEChERS d-SPE EMR-lipid（part no.5982-5158）均購(gòu)于安捷倫科技有限公司（Santa Clara，USA）。

1.2 氯霉素陽(yáng)性樣品的制備

選取兩個(gè)蜂場(chǎng)，取18kg洋槐蜂蜜，人工加入2kg果糖混合進(jìn)一步調(diào)節(jié)葡萄糖和果糖的比例，防止蜂蜜結(jié)晶。飼喂該添加果糖的蜂蜜樣品獲得空白樣品；再通過添加1μg/kg的氯霉素藥物于該飼喂的蜂蜜混合物中，飼喂蜜蜂一周后，取部分樣品經(jīng)初步測(cè)試，作為樣品的基體標(biāo)物候選物。

1.3 樣品的分析方法

1.3.1 樣品的前處理方法

蜂蜜基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)解凍后震蕩均勻，準(zhǔn)確稱取5.0g（精確至0.1mg）于50ml塑料離心管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線中添加的內(nèi)標(biāo)濃度，準(zhǔn)確量取200μg/kg的氯霉素-D5溶液23.0mg（約25μl，準(zhǔn)確記錄天平質(zhì)量），渦旋30s后4℃平衡1h。

提取與凈化：在離心管中加入5ml水，渦旋震蕩混勻1min；再加入10ml 1%氨水乙腈溶液（V/V）提取，渦旋提取1min；加入Agilent 5982-0032鹽包一袋，渦旋混勻2min，4℃ 8000r/min離心5min；取6ml上層提取液加入Agilent 5982-5158凈化包中，渦旋凈化1min，4℃ 8000r/min離心5min；取上層凈化液2ml，氮?dú)獯蹈?，最后加入?zhǔn)確稱取的50%乙腈水溶液1.0g，充分溶解，溶解液過0.22μm濾膜，上機(jī)。

表1 液相色譜洗脫程序

1.3.2 儀器分析條件

液相色譜條件：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1×50mm，1.8μm）色譜柱；流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為乙腈。溫度：40℃。優(yōu)化洗脫程序，確定梯度洗脫程序如表1所示。

質(zhì)譜條件：AJS ESI離子源負(fù)離子模式，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）；電離電壓：3500V；霧化器和碰撞氣：氮?dú)?；霧化器溫度：300℃；霧化器流速：6l/min；霧化器壓力40psi；氣簾氣流速：12l/min；氣簾氣溫度：350℃；定量離子對(duì)信息如表2所示。

1.4 樣品的均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)

1.4.1 均勻性檢驗(yàn)

根據(jù)《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》（JJF 1006-1994）和《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理的要求》（JJF 1343-2012），對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。記總體單元數(shù)為N，當(dāng)N≤200時(shí)，抽樣單元數(shù)不少于11個(gè)。從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的包裝中隨機(jī)抽取11個(gè)包裝，記錄編號(hào)為CAP-X（X為1，2，3，…），每個(gè)包裝樣品測(cè)定3個(gè)子樣，每個(gè)子樣中最小取樣量為5.0g，平行測(cè)定3次。按照液相色譜同位素稀釋質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)試并對(duì)測(cè)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（具體方法及參數(shù)見標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值部分）。方差分析法是用來統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均勻性最常用的方法，通過組間方差和組內(nèi)方差的比較來判斷不同包裝單元蜂蜜中氯霉素含量的測(cè)量值之間有無系統(tǒng)性差異。如果二者的比小于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的臨界值，則認(rèn)為樣品是均勻的。

1.4.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

穩(wěn)定性是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基本屬性，用于描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值隨時(shí)間變化的性質(zhì)，即描述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性的時(shí)間分布特征。為考察蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在長(zhǎng)期儲(chǔ)存條件以及外部環(huán)境變化條件影響下，物質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)和特性量值保持不變的能力，本研究根據(jù)JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》的要求，采用直線擬合法對(duì)蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量值開展長(zhǎng)期和短期的穩(wěn)定性評(píng)估考察。

1.5 樣品的定值和不確定評(píng)估

1.5.1 定值方法

本項(xiàng)目蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，采用液相色譜-同位素稀釋-串聯(lián)質(zhì)譜法作為測(cè)量方法，8家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值。8家實(shí)驗(yàn)室的定值數(shù)據(jù)經(jīng)過科克倫檢驗(yàn)和格布拉斯檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)等精度、無界外值，可保留并參與最終定值。

表2 氯霉素及其內(nèi)標(biāo)物MRM離子對(duì)信息

表3 洋槐蜂蜜原料的基本理化指標(biāo)

1.5.2 不確定評(píng)估

蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過程中引入的不確定度來源主要由3部分組成：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性引入的不確定度和、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值引入的不確定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 基體標(biāo)物材料的制備

根據(jù)已有研究及不同品種蜂蜜的性質(zhì)，當(dāng)果糖和葡萄糖比例（果葡比）大于1.3∶1時(shí)，蜂蜜不易結(jié)晶[8]。由于洋槐蜂蜜富含果糖且在長(zhǎng)期保存過程中穩(wěn)定不易結(jié)晶，雜質(zhì)少且質(zhì)地均勻，更適宜作為基體標(biāo)物的原料。因此，本研究取洋槐蜜作為基體，通過飼喂意大利蜂種蜜蜂以獲得含有氯霉素藥物殘留的蜂蜜基體樣品。

選擇符合監(jiān)測(cè)濃度的樣品（與市場(chǎng)上監(jiān)測(cè)的氯霉素陽(yáng)性樣本平均含量接近）經(jīng)過搖蜜、過濾、均質(zhì)、混勻等一系列工藝過程，得到約3500g的蜂蜜樣本。獲取的洋槐蜜的各項(xiàng)基本理化指標(biāo)參數(shù)如下表3所示。

將獲得的蜂蜜基體原料通過初步測(cè)試，其不易結(jié)晶，容易均質(zhì)均勻。通過蜂蜜均質(zhì)分裝儀用鋁袋真空分裝并封口，得到200單元每袋約15g的基體標(biāo)物樣本，于-20℃冷凍條件下儲(chǔ)存，進(jìn)行后續(xù)的標(biāo)物均勻性、穩(wěn)定性和定值等。

2.2 均勻性檢驗(yàn)

氯霉素蜂蜜基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，蜂蜜中氯霉素特性量值均通過F檢驗(yàn)，表明基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好，滿足技術(shù)規(guī)范要求。

表4 蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)結(jié)果(μg/kg，n=3）

表5 蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)結(jié)果（μg/l）

表6 蜂蜜中氯霉素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多家合作定值結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

將分裝的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于冰箱-20℃冷凍條件下保存，從2018年8月開始到2019年8月，本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已進(jìn)行了12個(gè)月的穩(wěn)定性考察，考察結(jié)果顯示在該包裝儲(chǔ)存條件下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在12個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的，結(jié)果見表5。

采用趨勢(shì)分析對(duì)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行考察，4℃、20℃（常溫）和40℃條件下氯霉素濃度可保持14天無明顯變化，在3種不同溫度條件下氯霉素濃度標(biāo)準(zhǔn)偏差無明顯差別，因此，本基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)運(yùn)輸過程中溫度要求并不嚴(yán)格，可以在低于40℃條件下短期運(yùn)輸。

2.4 定值與不確定評(píng)估

2.4.1 聯(lián)合定值

根據(jù)JJF 1006-1994一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范要求，針對(duì)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值可采用兩種不同原理的方法同時(shí)定值，或者采用一種方法多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方式。國(guó)際物質(zhì)量咨詢委員會(huì)（CCQM）將同位素稀釋質(zhì)譜法（IDMS）定位于具有絕對(duì)測(cè)量性質(zhì)的方法，IDMS方法是唯一公認(rèn)的痕量和超痕量分析權(quán)威測(cè)量方法[9]。然而，復(fù)雜基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般難以滿足兩種不同原理方法同時(shí)定值，通常采用國(guó)際計(jì)量領(lǐng)域公認(rèn)的、權(quán)威的絕對(duì)測(cè)量方法——IDMS結(jié)合多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方式[10]。另外，同位素內(nèi)標(biāo)法可以減少儀器及樣品提取率等一系列誤差和基質(zhì)干擾。因此，本實(shí)驗(yàn)室采用建立的高準(zhǔn)確度的IDMS方法對(duì)蜂蜜中的氯霉素進(jìn)行定值測(cè)定，定值結(jié)果由國(guó)內(nèi)8家檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證。

8家實(shí)驗(yàn)室的定值數(shù)據(jù)經(jīng)過科克倫檢驗(yàn)和格布拉斯檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)等精度、無界外值，可保留并參與最終定值，結(jié)果見表6。

根據(jù)《GB/T 4883-2008數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋-正態(tài)樣本離群值的判斷和處理》，首先采用狄克遜準(zhǔn)則對(duì)各實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，將定值結(jié)果按照由小到大的順序排列：

x(1)=0.61，x(2)=0.62，x(3)=0.62，

……

x(n-2)=0.84，x(n-1)=0.86，x(n)=0.88

又因?yàn)?/p>

同時(shí)，8家實(shí)驗(yàn)室均采用同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜方法作為定值方法，可以認(rèn)為屬于同等精度方法。從這一點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)一步采用科克倫（Cochran）準(zhǔn)則判斷這8組數(shù)據(jù)有無哪一組是可疑數(shù)據(jù)，按照標(biāo)準(zhǔn)，這里n取多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的測(cè)量次數(shù)9。

根據(jù)科克倫準(zhǔn)則，計(jì)算統(tǒng)計(jì)量：

查表得C（0.05,8,8）=0.3043，則C＜C（0.05,8,3）,判斷無可疑數(shù)據(jù)。經(jīng)過狄克遜和科克倫檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)等精度、無界外值，均符合定值要求。因此，蜂蜜氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量為多家聯(lián)合定值結(jié)果平均值0.72mg/kg。

2.4.2 不確定評(píng)估

蜂蜜中氯霉素的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果的不確定度是由均勻性、穩(wěn)定性和定值引入的不確定度3部分組成，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成相對(duì)不確定度計(jì)算結(jié)果如下：即

k=2時(shí)的相對(duì)擴(kuò)展不確定度：

3 結(jié)論

本研究通過蜂場(chǎng)飼喂給藥方式獲得了適合濃度的氯霉素自然污染的陽(yáng)性樣品。采用同位素稀釋質(zhì)譜法和多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值的方式，制備了蜂蜜氯霉素殘留基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。所獲得的氯霉素基體標(biāo)物，量值可靠，均勻性和穩(wěn)定性良好?？梢杂糜趯?shí)驗(yàn)室蜂蜜中氯霉素殘留檢測(cè)能力比對(duì)、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)質(zhì)量控制以及進(jìn)出口企業(yè)原料蜂蜜中氯霉素殘留檢測(cè)的質(zhì)控樣品。本項(xiàng)目研究的蜂蜜基體標(biāo)物對(duì)進(jìn)一步開展蜂蜜中的各類殘留基體標(biāo)物的研制具有參考價(jià)值。