陳云歡 吳旋 江一靜

缺血性腦卒中是一種高發(fā)病率、高致死率的疾病，腦缺血動物模型用于缺血性腦卒中治療的療效評價已有20 年的歷史。腦缺血后神經(jīng)元受損包括很多病理生理因素，如興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等。補(bǔ)陽還五湯由黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸、地龍、桃仁、紅花七藥組成，是治療氣虛血瘀型腦卒中的經(jīng)方、名方，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之效，補(bǔ)陽還五湯在臨床上治療腦缺血療效顯著[1]，然而其作用機(jī)制尚不明確。采用大鼠制備局灶性腦缺血模型是目前研究缺血性腦損傷發(fā)生機(jī)制及干預(yù)效果的重要手段[2]。自噬參與了生命體很多重要的過程，它一方面可以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，而另一方面亦可加速細(xì)胞死亡。在腦缺血性損傷后，自噬對神經(jīng)元兼具著神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)死亡的雙重作用。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬作為一種重要的神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控靶點(diǎn)，在補(bǔ)陽還五湯治療腦缺血中起著重要的調(diào)節(jié)作用。LAMP2 是一種溶酶體相關(guān)膜蛋白，作為CMA 的標(biāo)志性蛋白，它的表達(dá)水平直接決定了CMA 的活性。本實(shí)驗(yàn)采用改良線栓法制備大鼠腦缺血-再灌注模型[3]，用補(bǔ)陽還五湯進(jìn)行灌胃治療，觀察自噬-溶酶體信號通路的LAMP2 的表達(dá)情況，從細(xì)胞自噬角度探討補(bǔ)陽還五湯改善腦缺血的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

成年Wistar 大鼠50 只，雄性，100 ～150 g，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。50 只大鼠隨機(jī)分成四組：（1）正常對照組：10 只，假手術(shù)后，常規(guī)飼養(yǎng)于籠內(nèi)，不進(jìn)行任何干預(yù)治療。（2）模型組：10 只，造模后常規(guī)飼養(yǎng)于籠內(nèi)，不進(jìn)行任何干預(yù)治療。（3）補(bǔ)陽還五湯低劑量組：10 只，2.5 g/（kg·只）（按體表面積計算相關(guān)于成人劑量的0.5 倍），1 次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續(xù)灌胃7 d。（4）補(bǔ)陽還五湯中劑量組：10 只，5 g/（kg·只）（按體表面積算相當(dāng)于成人等效劑量），1 次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續(xù)灌胃7 d。（5）補(bǔ)陽還五湯高劑量組：10只，25 g/（kg·只）（按體表面積算相當(dāng)于成人等效劑量的5 倍），1 次/d，造模前灌胃7 d，造模后繼續(xù)灌胃7 d。

1.2 研究方法

1.2.1 補(bǔ)陽還五湯制備 各單味藥購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司，嚴(yán)格遵照原方配比而成，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院藥劑科完成，置于4 ℃下冷藏備用。

1.2.2 動物模型制備 術(shù)前禁食12 h，用3.4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上，采用改良線栓法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型，術(shù)后2 h 對大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評價。以Longa 5 級4 分法評價模型的神經(jīng)功能缺失癥狀。神經(jīng)功能評分后斷頭取出鼠腦。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR 擴(kuò)增 大鼠腦組織RNA 提取采用trizol 法，試劑購于thermo 賽默飛公司。

1.2.4 LAMP2 的引物設(shè)計 選擇Rat 的GAPDH 為內(nèi)參基因，依據(jù)實(shí)時熒光定量PCR（SYBR 法）引物設(shè)計原則，根據(jù)NCBI 登錄的GAPDH 基因mRNA 序列和大鼠的LAMP2 基因mRNA 序列，用Primer Premier 5.0 設(shè)計目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的特異性引物，用Oligo 6.0 檢驗(yàn)其特異性。引物（上海生工公司）序列為：

按下列組分配制PCR 反應(yīng)液，配制反應(yīng)液時先配制總的反應(yīng)液，再各個分裝。配制過程均在冰上進(jìn)行。每個反應(yīng)重復(fù)三次，設(shè)計實(shí)驗(yàn)組和陰性對照。PCR 反應(yīng)的程序設(shè)置：94℃ 30sec；94℃5sec；60℃34sec，共40 個循環(huán)。各組樣本采用△Ct 進(jìn)行基因相對表達(dá)差異檢驗(yàn)，P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；目的基因的相對表達(dá)量計算方法為2-△△Ct[4]。詳見表1。

1.3 觀察指標(biāo)

mRNA 相對定量：各組樣本采用△Ct 進(jìn)行基因相對表達(dá)差異檢驗(yàn)，各基因的mRNA 實(shí)際表達(dá)量與△Ct 值呈反比，即mRNA表達(dá)量越多，表明△Ct 值越小。P＜0.05 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，目的基因的相對表達(dá)量計算方法為2-△△Ct[4]。

1.4 數(shù)據(jù)收集處理與分析

數(shù)據(jù)用用SPSS 19.0 軟件分析，多組間數(shù)據(jù)差異比較采用單因素方差分析和多個樣本均數(shù)間的多重比較，采用（±s）表示，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯對大鼠神經(jīng)功能的影響

術(shù)后2 h模型組、低劑量組、中劑量、高劑量組與假手術(shù)組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后第7 天，補(bǔ)陽還五湯灌胃治療后大鼠神經(jīng)功能得到一定程度的恢復(fù)。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組與假手術(shù)組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。模型組與低劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與中劑量組和高劑量組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。低劑量組與中劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與高劑量組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。中劑量組與高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.2 實(shí)時熒光定量PCR 結(jié)果

各組之間mRNA 擴(kuò)增表達(dá)兩兩間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表3。以模型組為對照組，按2-△△Ct規(guī)則計算各組的LAMP2 mRNA 相對表達(dá)量，如圖1 示，正常組、低劑量組、中劑量組、高劑量組mRNA 相對表達(dá)水平較模型組均上調(diào)（均P＜0.01）。正常組表達(dá)量最高，高劑量組高于中劑量組，中劑量組高于低劑量組。以正常組為對照組，按2-△△Ct規(guī)則計算各組的LAMP2 mRNA 相對表達(dá)量，如圖2 示，高劑量組大于中劑量組，中劑量組大于低劑量組，低劑量組大于模型組（均P＜0.01）。

3 討論

腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷的機(jī)制復(fù)雜，與多種機(jī)制有關(guān)。缺血再灌注后，大鼠腦部缺血缺氧誘發(fā)興奮性氨基酸（EAA）毒性作用、一氧化氮（NO）細(xì)胞毒效應(yīng)、調(diào)控凋亡相關(guān)基因表達(dá)等因素[5-6]可致神經(jīng)功能受損。此外，細(xì)胞自噬在其中也扮演了重要角色，自噬是細(xì)胞程序性調(diào)控的重要生命活動之一。在哺乳動物低氧缺血、局灶性腦缺血或全腦缺血的模型中，都可誘發(fā)神經(jīng)元自噬[7-8]。細(xì)胞在缺氧情況下可激活自噬，通過降解損傷蛋白提供能量，并合成新的蛋白，對神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用。研究認(rèn)為細(xì)胞自噬能夠縮小缺血再灌注后病變大腦體積，緩解腦水腫，減少神經(jīng)元死亡，改善神經(jīng)功能和行為損傷，起到減輕神經(jīng)細(xì)胞受損的作用。然而，自噬的過度活化可能會導(dǎo)致細(xì)胞自體消化并誘發(fā)神經(jīng)元死亡，加重腦損傷程度[9-11]。

自噬-溶酶體途徑能為重要細(xì)胞功能提供營養(yǎng)物質(zhì)，還能清除多余或損傷的細(xì)胞器、錯誤折疊蛋白及入侵的微生物，有利于神經(jīng)功能恢復(fù)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[12]。哺乳動物的自噬-溶酶體途徑有三種形式：大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）以及分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone- mediatedautophagy，CMA）[13]。其中CMA 途徑能在熱休克蛋白（HSC70）等分子伴侶的介導(dǎo)下特異性地識別異常的蛋白質(zhì)，將其運(yùn)送到溶酶體膜上，溶酶體膜表達(dá)跨膜蛋白LAMP-1 和LAMP-2，兩者在功能上可相互代償。LAMP-2 是一種糖基化1 型膜蛋白，作為主要的溶酶體膜蛋白，直接參與了中性粒細(xì)胞的黏附、抗原提呈和分子伴侶性自噬。LAMP2 作為CMA 的標(biāo)志性蛋白，其在溶酶體膜上的表達(dá)水平直接決定了CMA 的活性[14-15]。

表1 各試劑名稱和使用量

表2 補(bǔ)陽還五湯對大鼠神經(jīng)功能評分的影響（±s）

表2 補(bǔ)陽還五湯對大鼠神經(jīng)功能評分的影響（±s）

注：1）與假手術(shù)組比較P ＜0．01；2）與中劑量比較，P ＜0．05，其中模型組與中劑量組比較，Z=-2．046，P=0．041；3）與高劑量比較，P ＜0．01，其中模型組與高劑量組比較，Z=-3．421，P=0．001；低劑量組與與高劑量組比較，Z=-3．31，P=0．001

組別 術(shù)后2 h 術(shù)后7 d假手術(shù)組 0 0模型組 2．17±0．51） 2．11±0．541）2）3）低劑量組 2．28±0．561） 1．94±0．461）3）中劑量組 2．17±0．431） 1．5±0．401）高劑量組 2．22±0．511） 1．11±0．301）

表3 各組LAMP2 mRNA 擴(kuò)增的△Ct（±s）

表3 各組LAMP2 mRNA 擴(kuò)增的△Ct（±s）

組別 例數(shù) △Ct正常 8 0．665±0．084模型 8 2．684±0．128低劑量 8 2．091±0．115中劑量 8 1．655±0．098高劑量 8 1．110±0．053

圖1 LAMP2 mRNA 的相對表達(dá)水平

圖2 LAMP2 mRNA 相對表達(dá)量

補(bǔ)陽還五湯是我國治療缺血性腦卒中的傳統(tǒng)名方，臨床療效確切。本研究中，采用改良線栓法制備大鼠腦缺血-再灌注模型，以Longa 5 級4 分法評價模型的神經(jīng)功能缺失癥狀。造模后2 小時，模型組，補(bǔ)陽還五湯低劑量組、中劑量組、高劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模7 天后，模型組與低劑量組，低劑量組和中劑量組，中劑量組和高劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。模型組與中劑量組、高劑量組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）：低劑量組與高劑量組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。研究結(jié)果表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，顯示補(bǔ)陽還五湯高劑量對大鼠腦缺血明確有效，低劑量明確無效，中劑量療效不明確，可能受樣本例數(shù)與老鼠對藥物反應(yīng)與體內(nèi)代謝各異有關(guān)。模型的實(shí)時熒光定量PCR 結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯對LAMP2 mRNA 表達(dá)量影響顯著，呈現(xiàn)出劑量依賴趨勢。模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組較正常對照組LAMP2RNA 表達(dá)量均降低（P＜0.01）：低劑量組、中劑量組、高劑量組較模型組LAMP2RNA 表達(dá)量均升高；補(bǔ)陽還五湯低劑量組、中劑量組、高劑量組之間倆倆比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），隨著劑量的增高表達(dá)量也增加。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯能通過上調(diào)LAMP2 表達(dá)影響CMA 的活性，進(jìn)而啟動自噬調(diào)控使腦缺血大鼠運(yùn)動感覺功能恢復(fù)和減輕腦損傷。但有關(guān)補(bǔ)陽還五湯如何調(diào)控，經(jīng)過什么信號傳導(dǎo)通路，有哪些細(xì)胞因子參與尚需要進(jìn)一步研究。