趙海新，黃曉群，陳書(shū)強(qiáng)，楊麗敏，杜曉東，張志強(qiáng)，蔡永盛，潘國(guó)君

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，黑龍江 佳木斯 154026）

不同植物物種對(duì)逆境適應(yīng)性存在差異，因其應(yīng)對(duì)調(diào)解機(jī)制不同[1]，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，即使這種調(diào)解機(jī)制差別微小，也可能造成物種分離與進(jìn)化[2]。自然逆境主要包括生物（病蟲(chóng)草害等）和非生物類(lèi)[3]（地理狀況、土壤類(lèi)型、極端氣候等），鹽堿化土壤是植物生長(zhǎng)非生物類(lèi)逆境。物種、品種及基因家族[4]對(duì)這種逆境壓力表現(xiàn)適應(yīng)性差異[5]，這種差異形成源于基因與蛋白質(zhì)組[6]，表現(xiàn)于植物生長(zhǎng)狀況和微觀結(jié)構(gòu)變化[7-8]。認(rèn)識(shí)植物對(duì)鹽堿脅迫反應(yīng)，是判斷植物耐鹽堿性重要基礎(chǔ)。植物微觀結(jié)構(gòu)對(duì)鹽堿脅迫響應(yīng)的相關(guān)報(bào)道較多，研究植物種類(lèi)也較廣泛，認(rèn)為植物葉綠體是亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)鹽分最敏感的細(xì)胞器[9-10]，可造成膜系統(tǒng)紊亂解體[11]，葉片PSⅡ反應(yīng)中心遭到破壞[12]。高強(qiáng)度脅迫使葉綠體迅速老化膨脹，基粒片層結(jié)構(gòu)扭曲解體[4]，基質(zhì)變稀，嗜鋨顆?？涨换痆5,10]，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)與數(shù)量亦有相應(yīng)變化[13]，甚至引發(fā)細(xì)胞程序性死亡[14]。

水稻分布地域廣泛，覆蓋地域土壤類(lèi)型豐富，其中包含大量鹽堿型土壤。水稻對(duì)鹽堿環(huán)境具有適應(yīng)性，但品種間存在差異[5,14]。研究主要集中于形態(tài)與生理機(jī)能方面[15]。通過(guò)一些微觀領(lǐng)域研究也表明，品種間葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)存在差異[5]，是否與對(duì)鹽堿環(huán)境適應(yīng)性有關(guān)則未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用堿性鹽脅迫苗期水稻，解析根系細(xì)胞形態(tài)和不同品種葉片細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)響應(yīng)機(jī)制，從微觀角度解析水稻受堿脅迫微觀表征和各細(xì)胞器響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：龍粳27、綏粳5號(hào)、藤系138和越光。龍粳27和綏粳5號(hào)源自于中國(guó)；藤系138和越光源自于日本。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)與氣候條件

試驗(yàn)地位于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，地理位置N46°49′、E130°22，屬于溫帶大陸性季風(fēng)中溫帶濕潤(rùn)氣候區(qū)，年均氣溫3℃，有效活動(dòng)積溫2 590℃，無(wú)霜期130 d，歷年年均降水量530 mm。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 幼苗前期培養(yǎng)

種子經(jīng)0.1%高錳酸鉀浸泡消毒24 h后，撒播在盛有石英砂托盤(pán)中，播量為100 g·m-2，沙子厚度2.5 cm，其中覆沙0.5 cm，淋水后，放入恒溫培養(yǎng)箱，溫度30℃，72 h后出齊苗取出，在室溫下生長(zhǎng)至2葉。

1.3.2 幼苗后期培養(yǎng)

培養(yǎng)盒上口尺寸為30 cm×20 cm，側(cè)面和底部用遮光紙封閉，其上覆蓋厚度1 cm泡沫載板，載板均勻打穿20個(gè)直徑1.0 cm培養(yǎng)孔（相鄰孔邊距5 cm×5 cm），每孔選取一株2葉期幼苗，用薄海綿條包卷主莖后，插入培養(yǎng)孔，使其固定在培養(yǎng)板上，于木村培養(yǎng)液中室外培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)液。

1.3.3 處理藥劑與時(shí)期

藥劑使用含Na2CO3和NaHCO3成分混合堿，兩者質(zhì)量比為1∶3，在水溶液中質(zhì)量濃度為0.20%。設(shè)對(duì)照（CK）和0.20%處理（CL），均為3次重復(fù)，室外處理。當(dāng)幼苗第3葉齡葉片完全展開(kāi)后，將培養(yǎng)液更換為含混合堿木村培養(yǎng)液（下稱(chēng)處理液，室溫，pH 9.01），對(duì)照CK生長(zhǎng)于木村培養(yǎng)液（室溫，pH 6.0），每2 d更換一次處理液和培養(yǎng)液，10 d后，摘取頂端第一片完全展開(kāi)葉片中段開(kāi)展測(cè)定和觀察。

1.4 指標(biāo)測(cè)定與方法

維管束、中柱和根直徑：取對(duì)照和處理各20條主根，電子顯微鏡下觀察拍攝橫截面，由電子顯微鏡圖像處理軟件獲取數(shù)據(jù)。各指標(biāo)比值乘以100%即獲得各項(xiàng)指標(biāo)間比值。

細(xì)胞長(zhǎng)寬與寬度：取對(duì)照和處理各20條主根，電子顯微鏡下觀察拍攝縱剖面，由電子顯微鏡圖像處理軟件獲取數(shù)據(jù)，縱向?yàn)榧?xì)胞長(zhǎng)度，橫向?yàn)閷挾?，通過(guò)計(jì)算獲取各項(xiàng)指標(biāo)間比值。

維管束數(shù)量：電子顯微鏡觀察對(duì)照和處理各20條根，取平均值。

維管束、中柱和根橫截面積：在標(biāo)準(zhǔn)紙上打印待測(cè)圖像，剪取待測(cè)指標(biāo)圖形，稱(chēng)重。使用軟件獲得標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度為邊長(zhǎng)，在同一張標(biāo)準(zhǔn)紙上繪制正方形，計(jì)算面積并稱(chēng)重，通過(guò)比重法計(jì)算即獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。各指標(biāo)比值乘以100%即獲得各項(xiàng)指標(biāo)間比值。

光合色素：采用李合生方法測(cè)定葉綠素a、葉綠素b、類(lèi)胡蘿卜素含量[16]。

細(xì)胞、葉綠體、線(xiàn)粒體及淀粉體面積：數(shù)據(jù)獲取同上述比重法，通過(guò)計(jì)算獲取各項(xiàng)指標(biāo)間比值。

1.5 觀察目標(biāo)及處理方法

1.5.1 根系細(xì)胞觀察方法

利用德國(guó)LeicaDM4000B電子顯微鏡，主要觀察冠根各部位橫截面及縱剖面細(xì)胞排列情況。切片用甲基紅溶液染色后，立即在目鏡放大率為10×122，物鏡放大率為×10倍下觀察照相。

1.5.2 葉片超微結(jié)構(gòu)處理方法

制作切片參照洪健等方法并加以改進(jìn)[17]。取主莖第4葉中間部分切成1 cm小段，迅速放至2.5%戊二醛中前固定，抽氣使材料下沉，于4℃固定2 d。pH 7.2磷酸緩沖液沖洗，再用2%四氧化餓固定1.5 h，pH 7.2磷酸緩沖液再次沖洗。使用乙醇逐級(jí)脫水，再用100%乙醇∶丙酮=1∶1、純丙酮各置換1次。用純丙酮：環(huán)氧樹(shù)脂812包埋劑逐級(jí)浸透（24 h）和包埋，浸透后在恒溫培養(yǎng)箱中，按40℃17 h，45℃24 h，60℃24 h聚合，ULTRACUTE型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛在25℃下分別對(duì)樣品染色15～20 min，雙重蒸餾水沖洗干凈后待檢，JSM25610LV透射電鏡下觀察拍照。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2013、DPS 18.10和SPSS 24.0軟件處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對(duì)水稻根細(xì)胞的影響

根據(jù)觀察結(jié)果，品種間根細(xì)胞形態(tài)變化趨勢(shì)相同，本試驗(yàn)部分以龍粳27和越光為例。

2.1.1 水稻根橫截面細(xì)胞

由圖1根橫截面細(xì)胞變化可知，對(duì)照根系各層位細(xì)胞排列整齊、清晰、緊湊，細(xì)胞形狀規(guī)則，立體感強(qiáng)，具有活性（見(jiàn)圖1-1，2），表皮覆有濃密根毛組織（見(jiàn)圖1-H），皮層薄壁細(xì)胞由內(nèi)向外，呈由小到大輻射狀排列。經(jīng)堿脅迫10 d后，皮層薄壁細(xì)胞排列相比對(duì)照明顯松散凌亂，染色后顏色分布不均勻，表皮根毛組織短小且呈芽狀（見(jiàn)圖1-3）。處理后根系維管柱初生大維管束組織數(shù)量相比對(duì)照減少1～3條，具有未完全發(fā)育的大維管束（見(jiàn)圖1-6-m）；對(duì)照內(nèi)皮層和中柱鞘細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)一致，處理組排列松散，脊?fàn)顓^(qū)域明顯，已木質(zhì)化。對(duì)照枝根數(shù)量較少，但經(jīng)堿脅迫后枝根較多。脅迫明顯打破水稻根細(xì)胞排列整齊性和緊湊性，抑制大維管束形成，未發(fā)育完全大維管束增加，抑制根毛生長(zhǎng)，促進(jìn)根系木質(zhì)化和枝根發(fā)育。已處理水稻主根橫截面具有較多褐色區(qū)域（見(jiàn)圖1-3-n），其顏色改變程度與滲出細(xì)胞液有關(guān)，說(shuō)明這些區(qū)域細(xì)胞生理功能已發(fā)生改變。堿脅迫處理后，龍粳27和越光變化趨勢(shì)一致，兩個(gè)水稻品種根系維管束數(shù)量、維管束與中柱直徑比值極顯著下降，中柱與根直徑比、維管束與根直徑比顯著上升（見(jiàn)表1）。由面積比數(shù)據(jù)可知（見(jiàn)表2），中柱內(nèi)維管束面積因脅迫，比例極顯著降低，根系內(nèi)中柱占橫截面比和維管束在根橫截面積中比顯著和極顯著上升。脅迫后維管束數(shù)量降低，但其直徑和面積占根系比卻顯著增加，說(shuō)明處理后單條維管束直徑相對(duì)增加，且細(xì)胞內(nèi)維管束面積之和相對(duì)增加。表明水稻為適應(yīng)堿性環(huán)境，通過(guò)提高維管柱和維管束在根橫截面中占比，保持物質(zhì)運(yùn)輸暢通，以此提高抗逆性。

2.1.2 水稻根縱剖面細(xì)胞

對(duì)根縱剖面觀察（見(jiàn)圖2）表明，對(duì)照細(xì)胞排列整齊有序，呈圓柱狀，皮層薄壁細(xì)胞立體感強(qiáng)，具有活性。處理后各層位細(xì)胞明顯縮短，立體感下降，中部薄壁細(xì)胞呈多角形，靠近外皮層薄壁細(xì)胞呈較小的長(zhǎng)方體，且部分細(xì)胞縱向長(zhǎng)度小于寬度，靠近內(nèi)皮層薄壁細(xì)胞呈圓形或短柱狀（見(jiàn)圖2-4，7），擺列有序性相比對(duì)照降低，且表皮細(xì)胞脫落（見(jiàn)圖2-5-o），中柱鞘細(xì)胞明顯變短細(xì)。與橫截面細(xì)胞排列不同，縱剖面細(xì)胞排列相比橫截面緊密。處理后水稻皮層薄壁和中柱鞘細(xì)胞均有深色斑點(diǎn)（見(jiàn)圖2-7，靠近內(nèi)皮層薄壁細(xì)胞部分區(qū)域顏色明顯變深。

表1 堿脅迫對(duì)維管束、中柱與根直徑的影響Table 1 Effects of alkali stress on the diameter of vascular bundle,central column and root

表2 堿脅迫對(duì)維管束與中柱占根系橫截面積比的影響Table 2 Effect of alkali stress on the ratio of vascular bundle and central column to root cross-sectional area

圖2 根縱剖面細(xì)胞結(jié)構(gòu)Fig.2 Cell struture of root radicle cross section

由圖2可知，堿脅迫明顯抑制水稻根系細(xì)胞縱向伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，造成根系生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞立體感因脅迫而降低，說(shuō)明根系已木質(zhì)化。皮層薄壁細(xì)胞、中柱鞘部分細(xì)胞因脅迫死亡。靠近內(nèi)皮層薄壁細(xì)胞受害較重，部分細(xì)胞群生理已發(fā)生變化。表皮細(xì)胞相比對(duì)照脫落較早，縱剖面圖亦發(fā)現(xiàn)正在形成枝根橫截面，對(duì)照較少，表明堿脅迫促進(jìn)水稻枝根形成。

由表3可知，處理后供試材料薄壁和中柱細(xì)胞長(zhǎng)寬比極顯著降低，表明堿脅迫抑制根細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，且達(dá)極顯著。龍粳27細(xì)胞長(zhǎng)度受抑制程度相比越光更顯著。中柱細(xì)胞長(zhǎng)與薄壁細(xì)胞長(zhǎng)比表明，品種之間出現(xiàn)反向變化趨勢(shì)。相對(duì)中柱細(xì)胞，堿脅迫對(duì)龍粳27薄壁細(xì)胞長(zhǎng)度抑制作用更顯著，對(duì)越光根系薄壁細(xì)胞和中柱細(xì)胞長(zhǎng)度的抑制為等比例抑制，即雖然細(xì)胞體積縮小，但縮小比例相同。中柱細(xì)胞寬與薄壁細(xì)胞寬比表明，堿脅迫對(duì)薄壁細(xì)胞寬度抑制作用更顯著，其中對(duì)龍粳27抑制作用達(dá)極顯著，對(duì)越光抑制作用達(dá)顯著。

綜合以上分析表明，堿脅迫對(duì)水稻根系細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生顯著或極顯著影響，對(duì)薄壁細(xì)胞抑制作用強(qiáng)于中柱細(xì)胞。但抑制作用因品種產(chǎn)生差異，本研究表明，龍粳27根細(xì)胞對(duì)堿脅迫更為敏感，細(xì)胞形態(tài)和體積產(chǎn)生較大變化，而對(duì)越光抑制主要表現(xiàn)為體積縮小。

表3 堿脅迫對(duì)根細(xì)胞長(zhǎng)度與寬度的影響Table 3 Effects of alkali stress on the length and width of root cells

2.2 堿脅迫對(duì)光合色素的影響

2.2.1 對(duì)葉綠素a、葉綠素b和類(lèi)胡蘿卜素的影響

由表4可知，堿脅迫后，各參試品種葉片葉綠素a、b、類(lèi)胡蘿卜素含量均呈極顯著下降，品種間下降幅度差異顯著，龍粳27和藤系138光合色素含量下降幅度均高于綏粳5號(hào)和越光，且達(dá)顯著或極顯著。龍粳27和藤系138葉綠素a/b值呈顯著下降，表明堿脅迫對(duì)兩份品種葉綠素a抑制作用強(qiáng)于葉綠素b；綏粳5號(hào)和越光葉綠素a/b值未下降或下降趨勢(shì)不顯著，表明對(duì)葉綠素a/b為等比例抑制。

表4 堿脅迫對(duì)光合色素的影響Table 4 Effects of alkali stress on photosynthetic pigments (mg·g-1)

所有參試品種光合色素含量均極顯著下降，表明堿脅迫對(duì)水稻葉片光合色素合成影響顯著（見(jiàn)表4），品種龍粳27和藤系138葉綠素a對(duì)堿脅迫最敏感，其次是葉綠素b，類(lèi)胡蘿卜素敏感性相對(duì)較弱；綏粳5號(hào)和越光葉綠素a和b對(duì)堿脅迫敏感性無(wú)差異，類(lèi)胡蘿卜素敏感性最弱。以上分析說(shuō)明，堿脅迫抑制光合色素合成，但不同水稻品種各光合色素下降幅度和敏感性差異顯著。

2.2.2 葉綠體、線(xiàn)粒體及淀粉體在細(xì)胞中比表面積變化

葉片細(xì)胞中葉綠體、線(xiàn)粒體和淀粉體占細(xì)胞比表面積因品種而產(chǎn)生差異（見(jiàn)表5）。堿脅迫后，龍粳27、綏粳5號(hào)和越光葉綠體、線(xiàn)粒體在細(xì)胞中比表面積顯著或極顯著增加，藤系138極顯著降低；龍粳27和藤系138淀粉體在葉綠體中比表面積極顯著下降，品種越光增加，且達(dá)極顯著，綏粳5號(hào)不顯著；線(xiàn)粒體與葉綠體比表面積數(shù)據(jù)表明，龍粳27和越光線(xiàn)粒體面積極顯著增加，藤系138極顯著降低，綏粳5號(hào)不顯著；線(xiàn)粒體和淀粉體比表面積數(shù)據(jù)表明，龍粳27和藤系138極顯著增加，綏粳5號(hào)和越光不顯著。

通過(guò)以上分析認(rèn)為，堿脅迫對(duì)亞細(xì)胞數(shù)量和體積影響顯著，這種影響將對(duì)各細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重要作用。不同水稻品種耐堿性強(qiáng)弱應(yīng)與各細(xì)胞器數(shù)量、體積、結(jié)構(gòu)和功能變化差異聯(lián)系緊密。

表5 超微圖像中細(xì)胞器比表面積分析Table 5 Specific surface area analysis of organelles and cells in ultramicro images

2.3 堿脅迫對(duì)水稻葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 對(duì)龍粳27超微結(jié)構(gòu)的觀察

龍粳27對(duì)照細(xì)胞內(nèi)葉綠體呈梭形，片層結(jié)構(gòu)豐富，基粒類(lèi)囊體分布均勻且較寬，基粒片層較多，可見(jiàn)基質(zhì)類(lèi)囊體（見(jiàn)圖3）。葉綠體中鑲嵌大量由體積較大的淀粉粒組成的淀粉體（見(jiàn)圖3-2），周?chē)植紨?shù)量較少的線(xiàn)粒體及細(xì)胞核（圖3-1，3），嗜鋨顆粒少。如圖3-7所示，經(jīng)堿處理后，細(xì)胞中仍存在大量葉綠體，但分布凌亂且有堆積現(xiàn)象。葉綠體中鑲嵌數(shù)量少、體積較小淀粉體。葉綠體中多數(shù)基粒片層腫脹（見(jiàn)圖3-6），且類(lèi)囊體偏向葉綠體一側(cè)，葉綠體基粒寬度明顯變細(xì)、混亂（見(jiàn)圖3-4，8），表明類(lèi)囊體降解。與對(duì)照相比線(xiàn)粒體仍分布在葉綠體周?chē)瑪?shù)量相對(duì)豐富，但明顯腫脹，內(nèi)脊稀疏，嗜鋨顆粒少量增多，表明有傷害。

圖3 龍粳27對(duì)照與0.20%堿處理超微結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructure of CK Longjing 27 and the one treated with 0.2%concentration alkali

由以上分析認(rèn)為，堿脅迫對(duì)龍粳27苗期微觀傷害主要是葉綠體和線(xiàn)粒體，依葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化和所含淀粉體數(shù)量和體積情況分析，傷害影響光合產(chǎn)物形成，線(xiàn)粒體數(shù)量雖增加，但由于內(nèi)脊數(shù)量少，且發(fā)生腫脹，因此呼吸消耗增強(qiáng)功能下降，且葉綠體合成光合產(chǎn)物少，淀粉合成減少，轉(zhuǎn)運(yùn)糖類(lèi)也減少，使植物體生理機(jī)能處于紊亂饑餓狀態(tài)，造成生長(zhǎng)量減少，最終枯黃。

2.3.2 對(duì)綏粳5號(hào)超微結(jié)構(gòu)的觀察

如圖4所示，未經(jīng)堿處理綏粳5號(hào)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰，線(xiàn)粒體呈線(xiàn)形、橢圓形或圓形，嵴清晰可見(jiàn)（見(jiàn)圖4-1），形狀豐富，表明代謝旺盛；大部分葉綠體呈梭形或橢圓形，基粒片層結(jié)構(gòu)清晰，基粒厚度較寬，堆積的類(lèi)囊體數(shù)量較多，兩相鄰基粒間距合理，連接基粒之間基質(zhì)片層較為清晰（見(jiàn)圖4-3）。鑲嵌在葉綠體中淀粉體數(shù)量較多（見(jiàn)圖4-2）。如圖4-5所示，處理后細(xì)胞葉綠體上嗜鋨顆粒豐富，葉綠體數(shù)量多，線(xiàn)粒體形狀各異，內(nèi)嵴豐富，大量分布在葉綠體周?chē)ㄒ?jiàn)圖4-5、6），葉綠體內(nèi)部基粒之間距離不均勻，基粒之間基質(zhì)類(lèi)囊體清晰，部分葉綠體基粒排序走向曲折紊亂，表明受害較重。部分葉綠體含有大量體積巨大淀粉粒（見(jiàn)圖4-8），將葉綠體基粒擠壓至邊緣，但基粒較清晰。部分淀粉體內(nèi)小淀粉粒與大淀粉粒之間有連絲相接，大淀粉粒又與淀粉體葉綠體被膜之間以連絲相接，增殖的小淀粉粒亦通過(guò)連絲由大淀粉粒提供淀粉化合物繼續(xù)生長(zhǎng)，表明堿處理后，綏粳5號(hào)淀粉合成與分化較為旺盛。

圖4 綏粳5號(hào)對(duì)照與0.20%堿處理超微結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of CK Suijing 5 and the one treated with 0.2%concentration alkali

與對(duì)照相比，葉綠體內(nèi)淀粉體體積較大，說(shuō)明堿處理后對(duì)綏粳5號(hào)葉綠體內(nèi)淀粉合成酶活力影響較小，光合產(chǎn)物存儲(chǔ)現(xiàn)象嚴(yán)重，圖4-7淀粉連絲表明淀粉合成、儲(chǔ)存、分生分化功能依然較強(qiáng)，淀粉粒體積過(guò)大，導(dǎo)致部分葉綠體受損較重，說(shuō)明淀粉體分化分生被動(dòng)發(fā)生，產(chǎn)生這種現(xiàn)象原因應(yīng)在糖類(lèi)運(yùn)移環(huán)節(jié)，既光合產(chǎn)物運(yùn)出葉綠體效率低，致使淀粉體體積過(guò)大。線(xiàn)粒體內(nèi)嵴較清晰，表明其受損情況較輕。以上分析表明堿脅迫后，綏粳5號(hào)葉片內(nèi)部分葉綠體形狀雖變化較大，但保持一定光合功能，打破光合產(chǎn)物運(yùn)移平衡，是造成生理紊亂的主要原因。綏粳5號(hào)綜合表現(xiàn)受害較輕，是一種耐鹽堿較強(qiáng)品種。

2.3.3 對(duì)藤系138超微結(jié)構(gòu)的觀察

如圖5所示，大量線(xiàn)粒體分布在對(duì)照葉綠體周?chē)ㄒ?jiàn)圖5-1），結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)脊比較清晰。葉綠體形狀呈梭形，基粒分布廣泛均勻，結(jié)構(gòu)正常，可見(jiàn)基粒類(lèi)囊體和基質(zhì)類(lèi)囊體，葉綠體內(nèi)含較豐富淀粉體（見(jiàn)圖5-2，3）。

處理后大量線(xiàn)粒體分布在葉綠體周，且內(nèi)脊清晰，說(shuō)明其代謝功能旺盛，葉綠體內(nèi)基粒厚度明顯變?。ㄒ?jiàn)圖5-4）或腫脹（見(jiàn)圖5-6），排序紊亂，內(nèi)含淀粉體顆粒減少，嗜鋨顆粒數(shù)量增多，嗜鋨程度變深。

圖5 藤系138對(duì)照與0.20%堿處理超微結(jié)構(gòu)Fig.5 Ultrastructure of CK Tengxi 138 and the one treated with 0.2%concentration alkali

堿脅迫后藤系138葉綠體基粒類(lèi)囊體數(shù)量減少，部分球形化，排序紊亂，合成淀粉體數(shù)量減少，但對(duì)線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)與功能、糖類(lèi)運(yùn)移功能等影響較小。綜上所述認(rèn)為，堿脅迫主要破壞藤系138葉綠體結(jié)構(gòu)，因此光合功能下降，合成產(chǎn)物減少，因此細(xì)胞代謝原材料供應(yīng)不足，是造成植株受害嚴(yán)重主要原因。

2.3.4 對(duì)越光超微結(jié)構(gòu)的觀察

對(duì)照葉綠體鑲嵌數(shù)量豐富的淀粉體，大部分葉綠體形狀呈梭形，基粒類(lèi)囊體數(shù)量較多，排列有序。線(xiàn)粒體數(shù)量較多，形狀各異，分布在葉綠體周?chē)ㄒ?jiàn)圖6-2），內(nèi)脊較多且清晰（見(jiàn)圖6-3），表明代謝旺盛。堿處理后淀粉體數(shù)量和體積明顯大于對(duì)照，每個(gè)淀粉體內(nèi)均有1～3個(gè)較大淀粉粒，圍生著數(shù)量更多的小淀粉體（見(jiàn)圖6-4）。處理后由于淀粉體體積增加過(guò)大，導(dǎo)致葉綠體形狀呈近圓形，基粒狹長(zhǎng)，類(lèi)囊體變稀疏（見(jiàn)圖6-5，8），但廣泛分布在葉綠體中。線(xiàn)粒體數(shù)量相比對(duì)照明顯下降且腫脹（見(jiàn)圖6-6，9），內(nèi)脊數(shù)量減少，說(shuō)明代謝功能受影響，呼吸作用增強(qiáng)。

圖6 越光對(duì)照與0.20%堿處理超微結(jié)構(gòu)Fig.6 Ultrastructure of CK Koshihikari and the one treated with 0.2%concentration alkali

堿處理后葉綠體類(lèi)囊體變化較大，但結(jié)構(gòu)清晰，因此光合功能影響相對(duì)較小。根據(jù)淀粉體數(shù)量及體積變化表明，淀粉體向葡萄糖轉(zhuǎn)化受阻。線(xiàn)粒體受害較重，因此品種越光受害生理特征為，脅迫后葉綠體結(jié)構(gòu)雖受影響，但光合作用仍繼續(xù)，糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)功能受阻，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能受?chē)?yán)重破壞，造成合成的光合產(chǎn)物大量積存于葉片中，形成的淀粉體無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)，植株生長(zhǎng)受阻。

3 討論與結(jié)論

3.1 脅迫對(duì)植物根細(xì)胞的傷害

植物細(xì)胞在脅迫條件下，其形態(tài)發(fā)生相應(yīng)變化，分生組織發(fā)生非正常分化[17]，郭望模等指出鹽脅迫下葉片下表皮細(xì)胞變小[18]，本研究發(fā)現(xiàn)薄壁細(xì)胞和中柱細(xì)胞長(zhǎng)度極顯著縮短，與此結(jié)論相似。內(nèi)外皮層細(xì)胞栓質(zhì)化與木質(zhì)化被認(rèn)為是植物適應(yīng)逆境的重要特征，植物根部通過(guò)木質(zhì)化促進(jìn)水分子運(yùn)輸，并限制Na+、Ca2+、Mg2+等離子自由運(yùn)移到外部，以提高抗逆性[19-20]，本研究觀察到皮層細(xì)胞木質(zhì)化現(xiàn)象，表明堿脅迫下水稻根系結(jié)構(gòu)向適應(yīng)逆境轉(zhuǎn)變。維管束是主要輸水組織，黃振英等報(bào)道顯示部分脅迫可促使植物根系維管柱徑向加粗、木質(zhì)化程度加深，導(dǎo)管數(shù)量增加，以提高根運(yùn)輸能力[19,21]，但本研究表明堿脅迫造成水稻根系大維管束數(shù)量減少，發(fā)育未完全的維管束增多，但部分圖像及數(shù)據(jù)顯示，維管束所占根徑向面積比增加，可能是水稻根系對(duì)逆境環(huán)境的適應(yīng)性響應(yīng)，與上述報(bào)道結(jié)果一致。

3.2 脅迫對(duì)植物細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的解析

關(guān)于逆境脅迫植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，國(guó)內(nèi)外學(xué)者均認(rèn)為，逆境對(duì)植物葉綠體、線(xiàn)粒體等細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞或降解作用[22-23]。本研究表明，堿脅迫導(dǎo)致葉綠體變形，基粒腫脹或片層數(shù)量減少，但此種變化在品種間存在差異，部分學(xué)者研究結(jié)論與此觀點(diǎn)一致[4,10]。超微結(jié)構(gòu)變化是復(fù)雜和動(dòng)態(tài)的過(guò)程，保持逆境中生理功能平衡是微觀結(jié)構(gòu)改變的根本原因。因此無(wú)法單一從某一個(gè)細(xì)胞器數(shù)量、形態(tài)或位置改變而定性。本研究通過(guò)觀察和分析分別來(lái)自中國(guó)和日本水稻品種，發(fā)現(xiàn)微觀結(jié)構(gòu)變化具有綜合性或整體性特點(diǎn)，同時(shí)這種變化具有共性和品種個(gè)性差異的特征。

葉綠體是對(duì)逆境脅迫最敏感的細(xì)胞器，本研究發(fā)現(xiàn)基粒類(lèi)囊體片層結(jié)構(gòu)減少或部分減少，通過(guò)基質(zhì)連接的部分類(lèi)囊體排列呈混亂或扭曲狀態(tài)；部分水稻品種其類(lèi)囊體偏向葉綠體一側(cè)（龍粳27），更多品種（綏粳5號(hào)、藤系138、越光）類(lèi)囊體位置變化不明顯。線(xiàn)粒體數(shù)量和結(jié)構(gòu)變化也因品種而異，龍粳27線(xiàn)粒體數(shù)量相對(duì)增加，腫脹明顯，內(nèi)脊變少，呼吸作用強(qiáng)烈，消耗增高，無(wú)法開(kāi)展三羧酸循環(huán)與氧化磷酸化途徑。同時(shí)合成淀粉粒體積大幅下降，表明葉綠體功能受損嚴(yán)重，光合產(chǎn)物3-磷酸甘油酸減少，機(jī)體生理運(yùn)轉(zhuǎn)效率嚴(yán)重降低，該品種整體機(jī)能處于匱乏狀態(tài)。堿脅迫后綏粳5號(hào)葉綠體中存儲(chǔ)大量體積巨大的淀粉粒，前人研究也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象，并依此判斷植物抗逆性狀[24]。脅迫后綏粳5號(hào)部分淀粉粒之間以及部分大淀粉粒與細(xì)胞膜之間產(chǎn)生連絲。本研究認(rèn)為，受到脅迫且結(jié)構(gòu)遭破壞的葉綠體，光合功能無(wú)法增強(qiáng)，由于光合作用合成的糖類(lèi)無(wú)法正常輸出而迅速轉(zhuǎn)化合成淀粉，導(dǎo)致淀粉在葉綠體中大量累積形成淀粉粒；大淀粉粒通過(guò)連絲向細(xì)胞膜輸送轉(zhuǎn)化的糖類(lèi)，但膜系統(tǒng)已受到損傷[25]，大部分糖類(lèi)又轉(zhuǎn)運(yùn)形成淀粉顆粒，或分生出小淀粉粒，但這種分化分生合成過(guò)程為被動(dòng)存儲(chǔ)。脅迫產(chǎn)生大量線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體輕微腫脹，說(shuō)明呼吸作用增強(qiáng)。嗜鋨顆粒變化可能是由于葉綠體類(lèi)囊體膜降解導(dǎo)致脂質(zhì)類(lèi)物質(zhì)在葉綠體或液泡中大量聚集。品種藤系138，脅迫后線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)較為正常，葉綠體損傷嚴(yán)重，葉綠體基粒類(lèi)囊體崩解（見(jiàn)圖5-5，6），說(shuō)明已無(wú)法光合作用，其他存儲(chǔ)少量淀粉粒的葉綠體，類(lèi)囊體結(jié)構(gòu)嚴(yán)重扭曲，較大淀粉體位于葉綠體中央位置，可能已失去轉(zhuǎn)化功能。盡管線(xiàn)粒體形態(tài)和功能正常，但缺少能源供應(yīng)。處理后品種越光葉綠體內(nèi)淀粉體數(shù)量和體積明顯大于對(duì)照，致使葉綠體形狀近于圓形，類(lèi)囊體片層減少，走向扭曲。與綏粳5號(hào)相似，但兩者差異明顯，即越光無(wú)連絲現(xiàn)象，因此淀粉體與糖之間的轉(zhuǎn)化過(guò)程相比綏粳5號(hào)較弱，處理后越光線(xiàn)粒體表面比極顯著增加，但結(jié)構(gòu)模糊，說(shuō)明呼吸消耗增大，功能受損較重，雖葉綠體參與光合作用，但糖類(lèi)轉(zhuǎn)化和光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)受阻。