袁 萍，江明鋒，官久強(qiáng)，安添午，張翔飛，羅曉林*

（1.西南民族大學(xué)青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用，四川省教育部重點實驗室，成都 610041；2.四川省草原科學(xué)研究院，成都 611731）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種典型革蘭氏陽性細(xì)菌，分布廣泛，易分離培養(yǎng)，具有抑制病原菌生長、增強(qiáng)免疫應(yīng)答、促進(jìn)養(yǎng)殖動物生長、凈化水質(zhì)等特點，在飼料、食品行業(yè)、基因工程和醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1]。關(guān)于枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的微生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)方法非常成熟，已測定多株枯草芽孢桿菌基因組序列[2]。枯草芽孢桿菌可利用低成本碳氮源大規(guī)模培養(yǎng)，因其可分泌大量胞外酶，如堿性蛋白酶（Extracellular alkaline protease，aprE）等，可將環(huán)境中不溶性蛋白質(zhì)降解為多種寡肽和氨基酸，并從中衍生出其他含氮化合物供菌體生長[3]?；诖颂匦?，有較強(qiáng)蛋白質(zhì)降解能力的枯草芽孢桿菌被篩選用于降低水體蛋白質(zhì)含量。

基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型（Genome-scale metabolic models，GEMs）通過基于約束的流量平衡算法，利用攝取和分泌通量有限數(shù)據(jù)預(yù)測代謝表型[4]。隨組學(xué)技術(shù)發(fā)展，GEMs提出與應(yīng)用已近20年?；谄鋵蛐秃捅硇完P(guān)系綜合性描述能力，GEMs已廣泛應(yīng)用于設(shè)計代謝工程策略和方面[5]。目前GEMs重構(gòu)在模式微生物如大腸桿菌等發(fā)展和應(yīng)用趨于成熟，非模式生物中應(yīng)用待進(jìn)一步研究[5-6]。枯草芽孢桿菌代謝模型已有相關(guān)報道，但利用GEMs通過分子與蛋白水平預(yù)測枯草芽孢桿菌對環(huán)境中蛋白質(zhì)降解能力研究較少。

隨水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化成為水產(chǎn)養(yǎng)殖主要問題。已有聯(lián)合利用枯草芽孢桿菌、光合細(xì)菌、硝化菌及反硝化菌等降解水體有機(jī)氮，改良水體富營養(yǎng)化相關(guān)研究。目前主要集中在調(diào)整不同細(xì)菌比例，根據(jù)有機(jī)氮或氨氮降解水平表型數(shù)據(jù)評估和篩選高效有機(jī)氮降解菌株，卻未見利用枯草芽孢桿菌基因組和代謝數(shù)據(jù)系統(tǒng)研究并基于計算推測其蛋白質(zhì)降解能力的相關(guān)報道。本試驗首次利用全基因組規(guī)模代謝模型作為整合調(diào)控途徑與枯草芽孢桿菌碳氮循環(huán)代謝模擬不同碳氮條件下枯草芽孢桿菌降解蛋白質(zhì)，使用菌株試驗數(shù)據(jù)和細(xì)胞內(nèi)通量數(shù)據(jù)評估模型準(zhǔn)確性，為系統(tǒng)篩選并最大化枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)降解能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

本研究DNA操作所需酶和試劑盒均購自Takara Biotechnology（日本）和Parkson基因技術(shù)有限公司（中國上海）。其他試劑均購自國藥控股化學(xué)試劑有限公司（中國上海），具有最高分析級。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基和基本培養(yǎng)基用于細(xì)菌培養(yǎng)。LB培養(yǎng)基由NaCl 10 g·L-1，胰蛋白10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1和1 L H2O組成。根據(jù)需要使用1.5%瓊脂固化。

魚粉蛋白培養(yǎng)基用于蛋白降解菌分離篩選。魚粉蛋白培養(yǎng)基由含 NaCl 0.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NH4Cl 2 g·L-1，KH2PO40.2 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，H2O 1 L和0.5 mL微量培養(yǎng)基（CoCl2·6H2O 0.1 g·L-1，MnCl2·4H2O 0.425 g·L-1，ZnCl20.05 g·L-1，NiCl2·6H2O 0.01 g·L-1，CuSO4·5H2O 0.015 g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.01 g·L-1，Na2SeO4·2H2O 0.01 g·L-1，pH 7.0）組成無機(jī)鹽培養(yǎng)基加入10 g·L-1魚粉蛋白作為唯一碳氮源。

改良葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基用于測定不同碳氮源條件下菌株生長速率和蛋白質(zhì)降解速率，葡萄糖10 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，不同濃度蛋白胨（40、30、20、10、5、3.3和2.5 g·L-1）。碳氮源比分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，2∶1，3∶1，4∶1。

1.2 菌株分離鑒定

本研究所用枯草芽孢桿菌菌株采自四川省成都二龍橋魚塘底部2～7 cm處泥層，用淤泥采樣器取50 g左右泥樣。采用文獻(xiàn)[7-8]方法從養(yǎng)殖水體中分離高效蛋白質(zhì)降解菌株。將10 g底泥接種到500 mL魚粉蛋白培養(yǎng)基中，37℃180 r·min-1培養(yǎng)72 h，提取10 mL培養(yǎng)基接種于500 mL魚粉蛋白培養(yǎng)基中，37℃180 r·min-1培養(yǎng)24 h。將少量培養(yǎng)基涂布在固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單克隆菌斑，接種于LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。使用通用引物27F（5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'）和1492R（5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'）PCR擴(kuò)增篩選得到菌株，獲得其16S rDNA。通過NCBI BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）對該 16S rDNA序列線上比對，利用MEGA X構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

1.3 菌株生長速率和菌株蛋白質(zhì)降解速率鑒定

本研究通過測定培養(yǎng)基中菌體干重變化計算不同培養(yǎng)條件下菌株生長速率。首先，將接種菌株的培養(yǎng)基在37℃180 r·min-1分別培養(yǎng)0、12和24 h后搖勻抽取50 mL，離心取沉淀加純水50 mL混勻沖洗，然后離心取沉淀，重復(fù)3次。最后將沉淀烘干稱重。

使用凱氏定氮法測定培養(yǎng)基中蛋白含量。將接種菌株LB培養(yǎng)基或魚粉蛋白培養(yǎng)基在37℃180 r·min-1培養(yǎng)0和12 h后搖勻抽取50 mL，離心取上清液10 mL加入Viskase公司MD44透析袋（8 000～12 000 D）透析去除無機(jī)氮源、氨基酸和小分子寡肽。定量透析產(chǎn)物并使用凱氏定氮儀（上海赫冠儀器有限公司）測定蛋白質(zhì)含量。

1.4 枯草芽孢桿菌HD-2菌株基因組DNA提取建庫測序及生物信息學(xué)分析

HD-2基因組DNA提取使用TaKaRa公司生產(chǎn)細(xì)菌基因組提取試劑盒。完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測收集基因組DNA。使用Covaris M220將基因組DNA打斷為長度300～500 bp片段。使用TruSeqTMDNA Sample Prep Kit建庫試劑盒構(gòu)建測序文庫并使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS試劑盒擴(kuò)增。最終文庫通過Illumina Hiseq 2000測序平臺完成掃描測序。測序產(chǎn)生的DNA序列數(shù)據(jù)以FastQ格式記錄，對原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)控并去除測序錯誤和低質(zhì)量測序片段。使用SOAPdenovo v2.04拼接軟件對測序片段組裝。使用Glimmer 3.02軟件預(yù)測細(xì)菌基因。

1.5 基因組規(guī)模代謝模型構(gòu)建和生長模擬校驗

使用 RAST軟件（http://rast.nmpdr.org/）注釋HD-2基因組預(yù)測得到的基因序列并通過MODEL SEED軟件生成包含有完整Gene-Protein-Reaction（GPR）列表初始代謝草圖。根據(jù)KEGG和BioCyc代謝數(shù)據(jù)完善并設(shè)定反應(yīng)方向。使用MEMOTE軟件評估模型完整性[10]，填補(bǔ)模型缺口，最終構(gòu)建菌株HD-2基因組規(guī)模代謝模型。

本試驗使用Cytoscape2.8.2軟件作網(wǎng)絡(luò)可視化，并使用其Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，查找核心功能所在子網(wǎng)絡(luò)[11]。此后，使用COBRA2.0分析流平衡[12]。分別使用生長速率最大和單一產(chǎn)物量最大作為目標(biāo)函數(shù)，函數(shù)如下：

maximize：biomass/target product

subject：S*v=0

0.01 ≤biomass≤0.02

通過模擬菌株在不同碳源和氮源條件下菌株最大生長速率，將模擬最大生長速率下碳氮比與試驗中結(jié)果比較，評估模型準(zhǔn)確性。

1.6 枯草芽孢桿菌不同碳氮源降解蛋白質(zhì)預(yù)測

利用上述構(gòu)建的GEMs模型，通過改變碳源氮源輸入濃度，模擬aprE基因不同碳氮比營養(yǎng)條件下表達(dá)變化。將文獻(xiàn)報道不同碳氮營養(yǎng)條件下枯草芽孢桿菌生長數(shù)據(jù)[3]與試驗測量結(jié)果和模擬結(jié)果比較。將模擬結(jié)果中蛋白酶合成速率最大碳氮源比例等同于試驗中測定蛋白質(zhì)降解速率最大時碳氮源比例，總蛋白酶合成量作為目標(biāo)函數(shù)，最大葡萄糖流量設(shè)定為0.0050 g·DW（dry weight，干重）-1·h-1，即包含0.0020 g碳元素碳源設(shè)置為碳源輸入量，將包含0.0004 g氮元素 0.0025 g·DW-1·h-1總蛋白作為細(xì)胞外初始氮源輸入量（初始條件：碳氮比為5∶1）。此后，以0.0005 g·DW-1·h-1梯度逐步提高細(xì)胞外氮源輸入量至0.0125 g·DW-1·h-1作為細(xì)胞外最終氮源輸入量，模擬碳氮比1∶1營養(yǎng)條件。分別模擬蛋白質(zhì)降解速率最大時碳氮比和蛋白酶合成量最大時碳氮比。調(diào)整模型中各反應(yīng)對應(yīng)流量變化范圍，使模擬結(jié)果與試驗結(jié)果數(shù)據(jù)變化趨勢一致。最后，利用調(diào)整后模型模擬分析連續(xù)梯度變化碳氮比條件下枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)降解，確定枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)降解最適碳氮源比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株選擇與鑒定

本研究分離鑒定得到1株不溶性蛋白質(zhì)高效降解菌株HD-2，12 h培養(yǎng)基中不溶性蛋白降解率達(dá)89.76%。表明HD-2具有高不溶性蛋白質(zhì)降解能力。以枯草芽孢桿菌HD-2基因組DNA為模板，利用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S rDNA，1.5 kb處有1條特異性條帶。純化16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并作序列測定。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌HD-2的16S rDNA長度為1 531 bp。在GenBank中BLAST比對分析，結(jié)果表明與菌株HD-2的16S rDNA序列相似性最高的是枯草芽孢桿菌BS49和BS34A菌株，達(dá)100%。利用其親緣關(guān)系標(biāo)注系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1，結(jié)果表明菌株HD-2屬于芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌。

2.2 枯草芽孢桿菌HD-2菌株基因組測序組裝和基因預(yù)測結(jié)果

枯草芽孢桿菌HD-2菌株基因組掃描測序共產(chǎn)生讀段（reads）15 412 018對，包含1 557 602 908個堿基，其中Q20以上reads占比92.77%。經(jīng)質(zhì)控保留有效reads共15 049 172對，1 415 852 922個堿基。有效reads組裝得到206個長序列片段（scaffolds），包含5 753 251個堿基，測序reads覆蓋深度234x，詳細(xì)測序和組裝結(jié)果見表1。

枯草芽孢桿菌HD-2的因預(yù)測結(jié)果包含5 585個可能基因序列，共4 953 741 bp個堿基?；蚱骄L度886 bp，基因座平均分布密度為每千堿基分布0.97個基因?；蛑衅骄鵊C含量為68.1%。全部基因序列儲存為ffn格式文件。基因組測序數(shù)據(jù)和組裝結(jié)果已提交至NCBI Genome數(shù)據(jù)庫，編號為SUB8287272。

圖1 利用HD-2菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic analysis of the 16S rDNA of strain HD-2

表1 枯草芽孢桿菌HD-2菌株基因組組裝結(jié)果Table 1 Results of B.subtilis strain HD-2 genome assembly

2.3 枯草芽孢桿菌HD-2菌株基因組注釋

通過RAST在線快速注釋軟件對枯草芽孢桿菌HD-2菌株作基因組注釋。注釋結(jié)果中包含已知功能基因1 968個，分屬30個主要子系統(tǒng)，包括各類生物大分子合成和代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)合成、化合物轉(zhuǎn)運(yùn)合成和生物防御運(yùn)動等細(xì)胞過程。其中與蛋白酶合成直接相關(guān)氮代謝相關(guān)基因20個，蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因129個和蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因25個（見圖2）。

HD-2編碼外分泌蛋白酶是6個包含編碼多個開放閱讀框基因簇。這6種蛋白酶分別為胞外中性金屬蛋白酶（EC 3.4.24.28）、解封氨肽酶（EC 3.4.11.-）、YpdF氨肽酶、D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶（EC 3.4.16.4）、耐高溫羧肽酶1（EC 3.4.17.19）和氨肽酶PepA（EC 3.4.11.1）。

2.4 枯草芽孢桿菌HD-2基因組規(guī)模代謝模型iBac2019構(gòu)建

本試驗構(gòu)建HD-2菌株基因組尺度代謝模型iBac2019。該模型分為細(xì)胞外和細(xì)胞質(zhì)兩個區(qū)域，共包含846個基因，1 394個反應(yīng)和1 490種化合物，其中包含82個轉(zhuǎn)運(yùn)反應(yīng)模擬大分子跨膜運(yùn)輸（見表2）。iBac2019還包含17個虛擬反應(yīng)，模擬轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因表達(dá)和被碳氮源供應(yīng)量限制的表達(dá)水平。這17個虛擬反應(yīng)包含存在于枯草芽孢桿菌中蛋白酶表達(dá)調(diào)控通路（見圖3），將轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程轉(zhuǎn)化為虛擬生化反應(yīng)，以便定量流平衡分析。

圖2 枯草芽孢桿菌HD-2注釋基因功能分類Fig.2 Gene annotation and classification in strain HD-2

表2 iBac2019模型基本參數(shù)Table 2 A summary of GEMs model iBac2019

圖3 枯草芽孢桿菌外泌蛋白酶表達(dá)調(diào)控通路Fig.3 Regulation pathways of exosprotease encoding genes in B.subtilis

2.5 iBac2019不同碳氮比下最大生長速率模擬

實驗室分別測定培養(yǎng)基碳氮比為1∶1、1∶2、1∶4、2∶1、4∶1條件下培養(yǎng)12 h菌體干重。根據(jù)試驗結(jié)果，所得不同碳氮條件下相應(yīng)生長速率如下：碳氮比為1∶1時0.0124 g·DW-1·h-1；碳氮比為1∶2時0.0093g·DW-1·h-1；碳氮比為1∶4時0.0051g·DW-1·h-1；碳氮比為2∶1時0.0212 g·DW-1·h-1；碳氮比為4∶1時0.0083 g·DW-1·h-1（見表3）。使用基于約束的重構(gòu)、分析和其軟件中內(nèi)置通量變異性分析，確定每個反應(yīng)通量邊界。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建iBac2019模型Biomass方程，見附件2。

將目標(biāo)條件設(shè)置為生長速率最大，模擬碳氮比為1∶3和3∶1條件下枯草芽孢桿菌最大生長速率分別為0.0072和0.0128 g·DW-1·h-1，與該條件下試驗測量值相差8.3%（0.0066 g·DW-1·h-1）和18.7%（0.0104 g·DW-1·h-1），模擬值與測量值變化趨勢吻合，表明模型仿真度較高。

2.6 通過目標(biāo)產(chǎn)物最大化實驗?zāi)M蛋白質(zhì)降解最適碳氮比

通過MCODE插件尋找模型中堿性蛋白酶合成和轉(zhuǎn)運(yùn)子網(wǎng)絡(luò)。子網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霰砻鞯鞍酌负铣赏泛吞即x通路關(guān)系緊密。通過與注釋信息比較，選擇模型中共有糖酵解、糖異生（30個反應(yīng)），TCA循環(huán)（18個反應(yīng)），丙氨酸、天冬氨酸代謝（15個反應(yīng)）以及胞內(nèi)、胞外蛋白水解（22個反應(yīng)）4個代謝通路共85個反應(yīng)組成蛋白酶分泌及其相關(guān)代謝反應(yīng)生物功能模塊。蛋白水解相關(guān)酶類共有胞內(nèi)蛋白水解酶16個和胞外蛋白水解酶6個（見表4）。

表3 不同碳氮源比例條件下枯草芽孢桿菌HD-2生長速率和蛋白質(zhì)濃度變化Table 3 Growth rate of B.subtilis HD-2 and the changes in protein concentration under different carbon-nitrogen ratio

表4 iBac2019模型中與蛋白降解相關(guān)的蛋白（酶）Table 4 Proteins(enzymes)related to protein degradation in iBac2019 model

續(xù)表

將該模塊內(nèi)總蛋白酶合成量作為目標(biāo)函數(shù)，將最大葡萄糖流量設(shè)定為0.0050 g·DW-1·h-1，即包含0.0020 g碳元素設(shè)置為碳源輸入量，將包含0.0004 g氮元素0.0025 g·DW-1·h-1總蛋白作為細(xì)胞外初始氮源輸入量，初始條件下碳氮比5∶1。在此條件上，以g·DW-1·h-1梯度逐步提高細(xì)胞外氮源輸入量至0.0125 g·DW-1·h-1總蛋白作為細(xì)胞外最終氮源輸入量，模擬碳氮比達(dá)1∶1。將胞外總蛋白上限設(shè)置為輸入蛋白量10倍，添加蛋白酶催化并轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)虛擬反應(yīng)。模擬菌株分泌蛋白酶，降解蛋白為可利用肽鏈并增加氮源輸入流量。設(shè)置上述條件，利用流平衡分析模擬該模塊，并記錄蛋白酶合成量和菌株最大生長量（見圖4）。

圖4 不同氮源細(xì)胞流量下枯草芽孢桿菌代謝模型生長速率和蛋白酶合成速率模擬結(jié)果Fig.4 Simulation results of growth rate and protein synthesis in B.subtilis under different quantity of nitrogen source

結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌在氮源進(jìn)入細(xì)胞流量達(dá)到0.0650 g·DW-1·h-1時生長量達(dá)到頂峰，之后生長速率停止增加。即在碳氮比約為2∶1時，生長速率進(jìn)一步增加開始受碳源供應(yīng)量約束，單純增加氮源供應(yīng)無法提高菌株生長速度。氮源進(jìn)入細(xì)胞流量增加至0.0350 g·DW-1·h-1時達(dá)到最大單位蛋白酶合成速率，氮源進(jìn)入細(xì)胞流量因氮源供應(yīng)不足而限制菌株蛋白酶合成。單位蛋白酶合成速率達(dá)到最大時進(jìn)一步供應(yīng)氮源雖增加菌株生長速率，但抑制蛋白酶合成分泌。最終，在考慮菌株生長速度和單位蛋白酶合成速率兩個影響因素后，總蛋白酶合成量如圖4所示，氮源進(jìn)入細(xì)胞流量達(dá)0.05000 g·DW-1·h-1時達(dá)到最大，此時碳氮比約為2.8∶1。進(jìn)一步試驗驗證，在碳氮比達(dá)2.6∶1時，枯草芽孢桿菌HD-2菌株溶液蛋白質(zhì)降解能力最高，達(dá)2.0000 mg·L-1·h-1。

3 討論

近年來，基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型廣泛應(yīng)用于真核及原核生物。由于原核單細(xì)胞細(xì)菌有較為簡單的基因組結(jié)構(gòu)及代謝通路，其代謝模型研究最為深入有效。目前，GEMs已在藥物生產(chǎn)、能源開發(fā)和健康監(jiān)測等多方面發(fā)揮重要作用。藥物生產(chǎn)方面，游動放線菌基因組規(guī)模代謝模型iYLW1028用于發(fā)酵模擬，顯著提高阿卡波糖含量[13]。能源開發(fā)方面，代謝網(wǎng)絡(luò)模型應(yīng)用于提高藍(lán)細(xì)菌生物乙醇生產(chǎn)效率[14]。在健康監(jiān)測方面，腸道菌群在機(jī)體健康中發(fā)揮重要作用，腸道菌群全基因組規(guī)模代謝模型已廣泛應(yīng)用于集體營養(yǎng)狀況檢測等[15]?？莶菅挎邨U菌作為一種模式細(xì)菌，其代謝網(wǎng)絡(luò)模型已構(gòu)建并發(fā)展至今[16]。與傳統(tǒng)GEMs相比，本模型整合最新組學(xué)數(shù)據(jù)，顯著提高預(yù)測代謝通量分布和表型能力。

枯草芽孢桿菌降氮能力運(yùn)用廣泛。據(jù)報道，枯草芽孢桿菌生物肥料可有效控制農(nóng)業(yè)氨氮排放，保持較高農(nóng)作物產(chǎn)量并減輕環(huán)境干擾[17]。此外，將枯草芽孢桿菌直接飼喂可降低犬糞便中氮發(fā)酵產(chǎn)物濃度和氣味[18]。在農(nóng)業(yè)及環(huán)境領(lǐng)域，篩選具有環(huán)境蛋白質(zhì)降解能力枯草芽孢桿菌菌株意義重大。本研究在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中分離鑒定得到1株高效降解蛋白質(zhì)菌株HD-2，利用其基因組掃描測序結(jié)果進(jìn)一步探究其蛋白質(zhì)降解潛能。

從機(jī)制上說，枯草芽孢桿菌可降解環(huán)境中不溶性蛋白質(zhì)，通過分泌胞外酶（如aprE基因產(chǎn)物等）使蛋白質(zhì)分解為多肽等，可進(jìn)一步攝取產(chǎn)生自身所需含氮化合物[19]。同時可通過電子傳遞鏈將氨轉(zhuǎn)化為氮氣釋放到空氣中，起到對水環(huán)境等脫氮效果[20]。大量分泌的蛋白酶和其基因表達(dá)調(diào)控因子表明這些胞外蛋白酶對宿主枯草芽孢桿菌的重要性，但這也對枯草芽孢桿菌生長代謝造成負(fù)擔(dān)，因此需根據(jù)其細(xì)胞所處營養(yǎng)狀況和外界環(huán)境嚴(yán)格控制枯草芽孢桿菌胞外蛋白酶表達(dá)[4]。本研究利用系統(tǒng)計算方法，調(diào)整HD-2所處營養(yǎng)條件，預(yù)測其蛋白質(zhì)降解能力，探究枯草芽孢桿菌HD-2最適蛋白質(zhì)降解條件。與現(xiàn)階段通過大規(guī)模篩選試驗尋找蛋白質(zhì)降解能力強(qiáng)菌株相比，本研究提出一種更高效便捷獲得環(huán)境氮降解菌株的方法。

4 結(jié)論

本研究成功分離得到枯草芽孢桿菌菌株HD-2，通過序列測定確定其親緣關(guān)系。基因組注釋分析得到20個與蛋白酶合成直接相關(guān)氮代謝相關(guān)基因、129個與蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因、25個與蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因以及6個分泌胞外蛋白酶。此外，利用枯草芽孢桿菌HD-2多組學(xué)數(shù)據(jù)重構(gòu)基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型iBac2019。利用此模型，預(yù)測不同碳氮條件下蛋白水解相關(guān)胞內(nèi)蛋白水解酶16個，胞外蛋白水解酶6個，獲得蛋白質(zhì)高效降解最優(yōu)生長狀態(tài)為碳氮比2.8∶1。通過試驗驗證預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)碳氮比達(dá)2.6∶1時，枯草芽孢桿菌HD-2菌株溶液蛋白質(zhì)降解能力最高。本研究成功將該模型應(yīng)用于枯草芽孢桿菌對蛋白質(zhì)降解能力預(yù)測，為從系統(tǒng)水平研究并篩選具蛋白質(zhì)降解能力枯草芽孢桿菌提供理論基礎(chǔ)。