吳振超，陳玉珂，高永生，王森，雷新雨， 于夢楠，張宇柔，張東鳴、3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林省動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)研究室，吉林 長春 130118； 3.通化師范學(xué)院，吉林 通化 134000)

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化規(guī)模的不斷擴(kuò)大，魚類疾病的發(fā)生也日趨嚴(yán)重，在養(yǎng)殖過程中魚類受小瓜蟲病、舌形絳蟲病、魚鰾積水癥、內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病、細(xì)菌性敗血病等多種疾病的困擾，一定程度上阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在疾病防治過程中，抗生素的使用起到了良好的效果，然而其大量使用的同時(shí)也給養(yǎng)殖環(huán)境和水產(chǎn)動(dòng)物腸道中有益微生物菌群的正常生長繁殖帶來了一定的負(fù)面影響?？股卦诃h(huán)境和水產(chǎn)品中的殘留危害了人類的健康，也阻礙了水產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易的數(shù)量[1]。目前，許多國家已經(jīng)明令禁止和限制抗生素的使用[2-3]，“無抗”養(yǎng)殖的大力推廣使抗生素的替代研究越來越受到學(xué)者們的重視。隨著對微生物學(xué)研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)，益生菌具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收[4]、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力和調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)微生態(tài)平衡等優(yōu)點(diǎn)，其作為抗生素的替代品在養(yǎng)殖領(lǐng)域取得了良好效果[5]，已成為水產(chǎn)飼料中最有潛力的抗生素替代品。同時(shí)，益生菌制劑具有無毒副作用、無耐藥性和效果顯著等特點(diǎn)，使得用益生菌替代抗生素成為一個(gè)切實(shí)可行的途徑[6]。

目前，在中國作為飼料添加劑的益生菌中芽孢桿菌類主要有地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis、凝結(jié)芽孢桿菌Bacilluscoagulans、蠟狀芽孢桿菌Bacilluscereus和枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis等[7]，其主要來自畜禽的腸道或其生長環(huán)境中。然而益生菌在宿主腸道的黏附作用具有特異性，因此，非同源的益生菌在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用效果并不理想[8]。所以種屬特異性是篩選益生菌的首要條件，而從水產(chǎn)動(dòng)物腸道中分離篩選益生菌成為大多數(shù)水產(chǎn)益生菌的主要篩選方法。本研究中，通過篩選一種安全有效的黃金鯽Carassiusauratus魚源益生芽孢桿菌，以期為黃金鯽魚源益生菌蠟狀芽孢桿菌的益生特性分析和安全使用提供參考，也為黃金鯽益生菌制劑的研發(fā)與應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為黃金鯽腸道中分離的一株潛在益生菌。指示菌株為2018年5月從黃金鯽腸道分離的4株指示菌，分別是蠟狀芽孢桿菌BacilluscereusHJJ2-5、嗜水氣單胞菌AeromonashydrophilaHJJ2-7、金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusHJJ2-8和大腸桿菌EscherichiacoliHJJ3-1，均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

供試黃金鯽于2018年6月采自吉林省梅河口市共安水產(chǎn)良種場。選擇活潑、無外傷、體形正常的健康黃金鯽(體質(zhì)量13.0 g±1.0 g)，經(jīng)1周馴化后進(jìn)行安全性檢測試驗(yàn)。暫養(yǎng)期間不投餌，連續(xù)充氣，水溫為(28±1)℃。

LB固體培養(yǎng)基，以及蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶試驗(yàn)培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[9]中的方法進(jìn)行配制。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與篩選

1) 細(xì)菌的分離、純化。將黃金鯽腸道內(nèi)容物原液按照10-3、10-4和10-5梯度稀釋，分別取各稀釋度的稀釋液100 μL均勻涂布于LB培養(yǎng)基上(每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù))，37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，待培養(yǎng)基上均勻長出單個(gè)菌落時(shí)進(jìn)行逐個(gè)劃線純化，直到平板上的菌落無雜菌出現(xiàn)為止。無菌條件下將篩出來的細(xì)菌菌液與體積分?jǐn)?shù)為40%的甘油等體積混合于凍存管中，使甘油終體積分?jǐn)?shù)為20%，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2) 細(xì)菌產(chǎn)酶試驗(yàn)。取100 μL供試菌液分別均勻涂布于淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶篩選試驗(yàn)培養(yǎng)基上(每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù))。置于恒溫箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h 后觀察是否有水解圈出現(xiàn)，并計(jì)算水解圈直徑與菌落直徑的比值，比值越大表示產(chǎn)酶能力越強(qiáng)。

3) 體外抑菌試驗(yàn)。采用牛津杯法測定各個(gè)菌株的抑菌活性[10]。取200 μL濃度為106CFU/mL的指示菌菌液均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基上，再將每個(gè)牛津杯中加入200 μL待測菌液， 37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，計(jì)算抑菌圈與菌落直徑的比值(每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù))。

4) 藥敏試驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[11]中的方法，將篩選出的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)16～18 h，取菌懸液100 μL 均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，將藥敏紙片貼于平皿培養(yǎng)基表面。置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h，并根據(jù)最后測量的抑菌圈直徑大小判斷菌株對抗生素的敏感性。試驗(yàn)結(jié)果依據(jù)《WS/T125—1999紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行判斷。

1.2.2 菌株的鑒定

1) 形態(tài)學(xué)鑒定。觀察菌株純化后的菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)。

2) 生理生化鑒定。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]，采用細(xì)菌生化微量反應(yīng)管對分離菌株生化特征進(jìn)行測定，并用吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的一株蠟狀芽孢桿菌(HJJ2-5)作為參考菌株，進(jìn)行對照試驗(yàn)。

3) 分子生物學(xué)鑒定。

DNA模板的制備：將菌株接種在平板上，于37 ℃下培養(yǎng)24 h，取單一菌落接種于LB培養(yǎng)液中，37 ℃下震蕩培養(yǎng)24 h。取1 mL細(xì)菌懸濁液按照試劑盒提取DNA,備用，并作為PCR反應(yīng)模板。

16S rRNA的PCR擴(kuò)增、克隆與測序：采用16S rRNA的PCR擴(kuò)增，通用引物為27F: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 和 1492R: TACGGYTACCTTGTTACGACT，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系(50 μL): 2×TransTaq?HiFi PCR SuperMixⅠ25 μL，DNA 模板3 μL，上、下游引物(10 μmol/μL)各 1 μL，雙蒸水20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃下預(yù)變性5 min;95 ℃下變性10 s，55 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸1.5 min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下再延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物純化后送至吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。

16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建[13]：將測定的菌株HJJ-1的16S rRNA序列在GenBank中進(jìn)行Blast分析，采用ClustalW法與相關(guān)菌屬不同種的16S rRNA序列進(jìn)行同源序列分析比對，測出目標(biāo)菌株序列與已知序列的相似程度后，再用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，以鄰位結(jié)合法(Neighbor-Join)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用自展法(Bootstrap)進(jìn)行1000次重復(fù)，并用一致性指數(shù)(Consistency index, CI)來衡量分析結(jié)果的可靠性。

1.2.3 細(xì)菌活菌數(shù)與OD值相關(guān)曲線的建立 參考林靜等[14]和李紹戊等[15]方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。

1) 菌液的制備及OD 值的測定。

一級(jí)菌液的制備：挑取單個(gè)純化后的菌落于LB液體培養(yǎng)基中，搖床(120 r/min，下同)37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，即為一級(jí)菌液。

二級(jí)菌液的制備：吸取 200 μL 一級(jí)菌液加至20 mL LB液體培養(yǎng)基中，吹打混勻，即為二級(jí)菌液，繼續(xù)放入搖床中37 ℃恒溫培養(yǎng)。

OD值的測定：用移液器分別吸取0、2、4、6、8、10 h 時(shí)的 200 μL二級(jí)菌液，測定其 OD600 nm值(試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù))。

2) 菌落平板計(jì)數(shù)。采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法，將菌液進(jìn)行 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8梯度稀釋，吸取各濃度菌液100 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基后，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。當(dāng)平板上的菌落數(shù)為 30～300 CFU時(shí)，即為合適的稀釋倍數(shù)，取3次菌落數(shù)的平均值乘以其稀釋倍數(shù)，即為 1 mL 菌液中的活菌數(shù)(CFU/mL)。

3) 活菌數(shù)與OD值的相關(guān)分析。通過分析數(shù)據(jù)可發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在生長對數(shù)期時(shí)菌液中的活菌數(shù)與其 OD600 nm值間存在著一定的對應(yīng)關(guān)系，并得到相應(yīng)的關(guān)系方程，可快速進(jìn)行菌液中活菌的計(jì)數(shù)，為菌液中活菌數(shù)量的測量提供依據(jù)。

1.2.4 耐性試驗(yàn)

1)高溫耐受性試驗(yàn)。由于芽孢桿菌為耐高溫菌株，故本試驗(yàn)中選擇 80 ℃為試驗(yàn)溫度[16]。將單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h后，按照10-5、10-6和10-73個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，同時(shí)放入80 ℃恒溫水浴鍋中，分別在2、5、10、20、30 min時(shí)各取菌液100 μL，流水冷卻后采用平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù)并計(jì)算細(xì)菌的存活率，以室溫下未經(jīng)水浴的菌液作為對照(每個(gè)濃度的試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù))。

相對存活率=處理后存活的平均菌數(shù)/對照組存活的平均菌數(shù)×100%。

(1)

2)酸性耐受性試驗(yàn)。用37% 的 HCl 溶液將液體LB培養(yǎng)基的 pH調(diào)至3、4、5，高壓蒸汽滅菌，對照組培養(yǎng)基的pH調(diào)至7.2，備用。

挑取單個(gè)純化后的菌落于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，搖床37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h后，用移液器取2 mL菌液分別接種于pH為 3、4、5及對照組20 mL培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)，5 min后開始計(jì)時(shí)，分別于1、2 h時(shí)取液，按照10-5、10-6和10-73個(gè)稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，取100 μL涂布于固體培養(yǎng)基上，用平板計(jì)數(shù)法檢測活菌數(shù)，按式(1)計(jì)算存活率(每個(gè)濃度的試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù))。

3) 胃液耐受性試驗(yàn)。配制試驗(yàn)組和對照組液體LB培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌，備用。

胃液配制：取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的鹽酸16.4 mL加蒸餾水稀釋，按 1 mg/mL在溶液中加入胃蛋白酶，充分溶解后用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。

將試驗(yàn)組培養(yǎng)基pH調(diào)至3，按0.5 mg/mL加入胃液，對照組不加胃液。將2 mL細(xì)菌接種于20 mL液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)方法及菌液稀釋梯度同“酸性耐受性試驗(yàn)”，只是取液時(shí)間為0.5、1、2、3、4 h時(shí)，并按式(1)計(jì)算存活率(每個(gè)濃度的試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù))。

4) 腸液耐受性試驗(yàn)。配制試驗(yàn)組和對照組液體LB培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌，備用。

人工腸液配制：取KH2PO41.36 g，加至100 mL培養(yǎng)基中溶解，按 10 mg/mL加入胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH至6.8，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，對照組培養(yǎng)基不加人工腸液。將2 mL細(xì)菌接種于20 mL液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)方法及菌液稀釋梯度同“酸性耐受性試驗(yàn)”，只是取液時(shí)間為0.5、1、2、3、4 h時(shí)，并按式(1)計(jì)算存活率(每個(gè)濃度的試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù))。

5) 膽鹽耐受性試驗(yàn)。配制試驗(yàn)組和對照組液體LB培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌，備用。

在配制好的試驗(yàn)組培養(yǎng)基中按0.3 mg/mL加入膽鹽，調(diào)至pH為6.8，完全溶解后混勻。對照組培養(yǎng)基不加膽鹽，使用 0.22 μm 的濾器對培養(yǎng)基進(jìn)行過濾除菌。取2 mL細(xì)菌接種于20 mL液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌培養(yǎng)方法及菌液稀釋梯度同“酸性耐受性試驗(yàn)”，只是取液時(shí)間為0.5、1、2、3、4 h時(shí)，并按式(1)計(jì)算存活率(每個(gè)濃度的試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù))。

1.2.5 黏附試驗(yàn)

1) 細(xì)菌培養(yǎng)。將純化后的菌液在搖床中培養(yǎng)16～18 h后，離心收集沉淀菌體，用PBS(pH 7.2)洗滌2次，將離心收集的菌體懸浮于Hepes-Hanks溶液中，調(diào)整細(xì)菌濃度為1.0×108CFU/mL，置于4 ℃冰箱中備用。

2) 黏液蛋白制備。剖取健康黃金鯽前腸，縱向剖開腸管，參照Ouwehand等[17]的方法，用含0.01% 明膠的PBS將腸道內(nèi)容物沖洗干凈，然后刮取腸道內(nèi)表面，得到黏液蛋白混合物，將其轉(zhuǎn)移至Hepes-Hanks溶液中(10 mg/mL)離心，取上清液，并調(diào)整其質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL左右，分裝后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3) 細(xì)菌染色。向菌懸液中加入Hoechst 33258染色液，調(diào)整其最終質(zhì)量濃度為2 μg/mL，37 ℃下避光染色30 min后用PBS洗滌2次，離心收集菌體，將其懸浮于Hepes-Hanks溶液中，調(diào)整細(xì)菌濃度為1.0×108CFU/mL，置于4 ℃冰箱中備用[18]。

4) 體外黏附試驗(yàn)。取100 μL蛋白黏液加至96 孔黑色聚苯乙烯培養(yǎng)板中，4 ℃下固定24 h后，每孔加200 μL Hepes-Hanks溶液洗滌培養(yǎng)板后，每孔加100 μL 染色后的細(xì)菌(1.0×108CFU/mL)，37 °C下孵育1 h，再次洗滌培養(yǎng)板后每孔加入200 μL 1% SDS-0.1 mol/L NaOH裂解液，60 ℃下孵育1 h。陰性對照，每孔加100 μL未標(biāo)記的細(xì)菌(1.0×108CFU/mL)；陽性對照，每孔加100 μL 標(biāo)記的細(xì)菌(1.0×108CFU/mL)。使用熒光酶標(biāo)儀測定熒光值，激發(fā)波長為340 nm，熒光發(fā)射波長為460 nm(每個(gè)試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù))。

黏附率=(試驗(yàn)組熒光強(qiáng)度-陰性對照熒光強(qiáng)度)/(陽性對照熒光強(qiáng)度-陰性對照熒光強(qiáng)度)×100%。

(2)

1.2.6 安全性檢測 試驗(yàn)用黃金鯽經(jīng) 1 周馴化后，選擇適應(yīng)環(huán)境、體格健壯的150 尾魚，隨機(jī)分為5組，每組30 尾，采用腹腔注射法，4個(gè)試驗(yàn)組每尾魚分別注射濃度為1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/mL的菌懸液各200 μL，對照組注射200 μL無菌生理鹽水。注射試驗(yàn)結(jié)束后將黃金鯽放回原水環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)，每日記錄死亡情況，連續(xù)觀察7 d，最后進(jìn)行解剖檢查有無病變。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S.E.)表示。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株產(chǎn)酶能力的測定

本試驗(yàn)中共篩選出5株可同時(shí)產(chǎn)3種酶的菌株，如表1所示，其中，HJJ-1菌株產(chǎn)蛋白酶能力(H/D=3.99)和產(chǎn)淀粉酶能力(H/D=2.22)均顯著高于其他菌株(P<0.05)，而HJJ-3菌株產(chǎn)脂肪酶能力(H/D=2.64)顯著高于其他菌株(P<0.05)。因此，共篩選出HJJ-1和HJJ-3兩個(gè)菌株作為潛在益生菌，進(jìn)行下一步篩選。

表1 分離菌株的產(chǎn)酶能力比較

2.2 體外抑菌試驗(yàn)

體外常見病原菌的拮抗試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，其中，HJJ-1菌株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有較好的拮抗作用，而HJJ-3菌株僅對嗜水氣單胞菌產(chǎn)生拮抗作用。因此，最終篩選出HJJ-1菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表2 常見病原菌拮抗試驗(yàn)Tab.2 Antagonistic test selection of bacteria

2.3 藥敏試驗(yàn)

從表3可見：HJJ-1菌株對青霉素、磺胺異惡唑、利福平和頭孢拉定等4種抗生素產(chǎn)生耐藥性；對呋喃唑酮中度敏感；對紅霉素、新霉素、卡那霉素、慶大霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、左氧沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、諾氟沙星和妥布霉素等11種抗生素均高度敏感。

表3 HJJ-1菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of antibiotic sensitivity test of the isolated bacteria

2.4 菌株鑒定

2.4.1 菌株的形態(tài)特征 通過對黃金鯽腸道細(xì)菌的分離與純化，經(jīng)篩選后獲得一株優(yōu)勢菌株，命名為HJJ-1，該菌株在有氧或無氧條件下均能生長。

1) 菌落形態(tài)(圖1A)。將HJJ-1菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，經(jīng)37 ℃下培養(yǎng) 18～24 h 后，菌落表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，擴(kuò)展?fàn)?，邊緣不整齊，乳白色，不光滑，半透明或不透明，似蠟燭樣顏色。

2) 個(gè)體形態(tài)(圖1B)。HJJ-1經(jīng)革蘭氏染色試驗(yàn)后呈陽性，兩端鈍圓，細(xì)胞形態(tài)為短桿狀，呈短鏈或長鏈。

3) HJJ-1菌株在液體培養(yǎng)基中與對照組空白液體LB培養(yǎng)液比較(圖1C)，呈均勻混濁生長，乳白色，培養(yǎng)24 h后形成小塊狀沉淀，振搖不散。

2.4.2 生理生化特征 從表4可見：常規(guī)生理生化分析試驗(yàn)結(jié)果表明，HJJ-1菌株有運(yùn)動(dòng)性，過氧化氫酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、卵磷脂酶試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、卵黃反應(yīng)試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、革蘭氏染色試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、L-谷氨酸試驗(yàn)、L-組氨酸試驗(yàn)、L-絲氨酸試驗(yàn)、L-天冬氨酸試驗(yàn)、1% NaCl生長試驗(yàn)、3% NaCl生長試驗(yàn)、6% NaCl生長試驗(yàn)、28 ℃生長試驗(yàn)、37 ℃生長試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)及酪素水解試驗(yàn)均呈陽性；吲哚試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生試驗(yàn)、10% NaCl生長試驗(yàn)、10 ℃生長試驗(yàn)、45 ℃生長試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)及賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)均呈陰性；可還原硝酸鹽，能分解蔗糖、果糖、麥芽糖，不能分解甘露醇、木糖、乳糖、纖維二糖、D-棉子糖、L-鼠李糖及肌醇。所分離的菌株形態(tài)和生理生化特性與本試驗(yàn)中所用的標(biāo)準(zhǔn)菌株蠟狀芽孢桿菌HJJ2-5基本一致，初步鑒定所分離目標(biāo)菌株為蠟狀芽孢桿菌。

表4 菌株生化鑒定結(jié)果Tab.4 Biochemical identification results of the stains

2.4.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 將菌株HJJ-1的16S rRNA測序所得序列在NCBI中進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示，菌株HJJ-1與蠟狀芽孢桿菌16S rRNA基因一致性達(dá)到100%，這說明菌株HJJ-1與蠟狀芽孢桿菌同源性最高。用MEGA 5.0軟件中的鄰接法(NJ)構(gòu)建13個(gè)菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，菌株HJJ-1與蠟狀芽孢桿菌(AY138279.1、KJ948667.1、EF100616.1、KT982242.1)聚為同一分支，說明親緣關(guān)系較近(圖2)。結(jié)合形態(tài)、生理生化特征及16S rRNA序列鑒定結(jié)果，最終將菌株HJJ-1鑒定為蠟狀芽孢桿菌。

2.5 細(xì)菌濃度與 OD 值的相關(guān)性

菌株HJJ-1在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD600 nm值、平板計(jì)數(shù)的菌落數(shù)、稀釋倍數(shù)、1 mL 菌液內(nèi)的活菌數(shù)如表5所示。測定HJJ-1菌液在 0～10 h 內(nèi)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 OD600 nm值，由于10 h時(shí)間點(diǎn)的OD600 nm值誤差過大，不利于生長曲線的擬合，故將其舍棄。以涂板計(jì)數(shù)得到的活菌數(shù)為y軸，以菌液OD600 nm值為x軸，得到活菌數(shù)與OD600 nm值的相關(guān)曲線方程為y=5.493 3e7.823 8x(R2=0.990 2)(圖3)。

表5 HJJ-1菌數(shù)值匯總Tab.5 Summary of HJJ-1 bacterium

2.6 耐性試驗(yàn)

2.6.1 高溫耐受試驗(yàn) 從圖4(a)可見：HJJ-1菌株在不同時(shí)間點(diǎn)下對高溫的耐受性有顯著性差異(P<0.05)，但在短時(shí)間的高溫處理下，各菌株保持著較高的存活率；隨著水浴時(shí)間的延長，菌株的存活率逐漸降低，菌株在2 min條件下的存活率顯著高于30 min條件下的存活率(P<0.05)。

2.6.2 酸性耐受試驗(yàn) 從圖4(b)可見：菌株在不同pH條件下的存活率有顯著性差異(P<0.05)，在pH為3～5范圍內(nèi)，隨著pH升高，1、2 h取樣組的存活率均顯著升高(P<0.05)，且HJJ-1菌株在不同pH條件處理下，1 h取樣組存活率均高于2 h組，但無顯著性差異(P>0.05)，這說明HJJ-1菌株具有良好的酸性耐受能力。

2.6.3 胃液耐受試驗(yàn) 從圖4(c)可見：HJJ-1菌株在不同時(shí)間下對胃液的耐受能力有顯著性差異(P<0.05)；隨著時(shí)間的延長，菌株存活率顯著降低(P<0.05)，但在4 h時(shí)菌株的存活率仍達(dá)62.91%，這說明其具有良好的胃液耐受能力。

2.6.4 腸液耐受試驗(yàn) 從圖4(d)可見：HJJ-1菌株在處理0.5 h和1 h間的存活率無顯著性差異(P>0.05)，均達(dá)到92%以上；隨著處理時(shí)間的延長，存活率顯著降低(P<0.05)，但菌株在處理4 h時(shí)的存活率仍達(dá)到69.54%，這說明菌株HJJ-1對腸液有較好的耐受能力。

2.6.5 膽鹽耐受試驗(yàn) 從圖4(e)可見：隨著時(shí)間的延長，菌株存活率顯著降低(P<0.05)；HJJ-1菌株在處理4 h時(shí)，存活率仍在65.43%以上，在處理0.5 h時(shí)的存活率最高，為88.5%，這說明菌株對膽鹽也具有一定的耐受能力。

2.7 黏附試驗(yàn)

根據(jù)黏附試驗(yàn)結(jié)果(圖4(f))，計(jì)算出菌株HJJ-1對黃金鯽腸道黏液的黏附率為18.1%。

2.8 安全性測試結(jié)果

安全性檢測試驗(yàn)結(jié)果顯示，黃金鯽注射1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/mL的菌懸液后，與對照組相比均未出現(xiàn)死亡，存活率均為100%，解剖發(fā)現(xiàn)，對照組和試驗(yàn)組內(nèi)臟均正常無變異。這說明HJJ-1菌株對黃金鯽具有較好的安全性。

3 討論

3.1 菌株的篩選及鑒定

本試驗(yàn)在篩選益生菌的過程中，以篩選出適合魚類飼料中添加劑型的益生菌為主要目的，初步比較了細(xì)菌的產(chǎn)酶能力和對常見病原菌的拮抗能力，并進(jìn)一步檢測了細(xì)菌對抗生素的敏感性，將產(chǎn)酶能力和拮抗病原菌能力強(qiáng)、攜帶抗生素耐藥因子少的菌株篩選出來作為潛在益生菌，進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

本研究中從黃金鯽腸道中篩選得到一株潛在益生菌 HJJ-1，具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力，將其作為益生菌添加到魚類飼料中，可促進(jìn)機(jī)體對營養(yǎng)成分的消化和吸收，丁賢等[19]研究發(fā)現(xiàn)，用含芽孢桿菌的飼料投喂南美白對蝦Penaeusvannamei，可提高南美白對蝦的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性。拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明，HJJ-1菌株對致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有拮抗性，提示其可用于感染大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引發(fā)的魚類疾病的防治，這與SA38蠟樣芽孢桿菌在體外對3株病原細(xì)菌有拮抗作用[20]且能強(qiáng)烈抑制大腸桿菌生長[21]的研究結(jié)果一致?？股孛舾性囼?yàn)結(jié)果顯示，HJJ-1菌株僅對青霉素、磺胺異惡唑、利福平和頭孢拉定等4種抗生素產(chǎn)生耐藥性，攜帶耐藥因子較少。綜合革蘭氏染色鏡檢試驗(yàn)、形態(tài)特征觀察及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定菌株HJJ-1是革蘭氏陽性菌，生理生化特征試驗(yàn)結(jié)果與蠟狀芽孢桿菌基本一致；對分離的 HJJ-1菌株進(jìn)行16S rRNA 序列測定及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，HJJ-1菌株與蠟狀芽孢桿菌一致性高達(dá)100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為同一分支。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，將HJJ-1菌株最終鑒定為蠟狀芽孢桿菌。

3.2 菌株的黏附能力及耐性分析

目前，盡管益生菌的應(yīng)用已十分廣泛，但飼用益生菌產(chǎn)品至今尚無完備的評價(jià)體系，產(chǎn)品質(zhì)量無法規(guī)范控制，導(dǎo)致益生菌產(chǎn)品的作用效果參差不齊，嚴(yán)重影響益生菌添加劑的實(shí)際應(yīng)用。如在飼料工業(yè)上，高溫、高壓條件均會(huì)對細(xì)菌產(chǎn)生一定的影響[22]。有研究表明，乳酸菌在制粒后的死亡率高達(dá)95%以上[23]，且由于動(dòng)物胃腸道內(nèi)的低pH、膽鹽及其他多種酶類[18]，導(dǎo)致飼用益生菌進(jìn)入消化道后難以定植[24]，細(xì)菌對腸道的黏附能力也是影響益生菌產(chǎn)品穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。為此，本試驗(yàn)中建立飼用益生菌評價(jià)體系，通過檢測菌株的耐高溫能力、耐酸能力、耐膽鹽能力、耐胃液能力、耐腸液能力及對腸道黏液蛋白的黏附能力，反映益生菌對宿主產(chǎn)生的有益作用，同時(shí)也為益生菌產(chǎn)品質(zhì)量控制的指標(biāo)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，HJJ-1菌株在耐高溫、耐酸、耐膽鹽、耐胃液和耐腸液試驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的耐受性，且可以黏附在黃金鯽腸道黏液蛋白上。何月英等[25]研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌在60～90 ℃下處理10～20 min仍能生長；張璐[18]在試驗(yàn)中指出，3種芽孢桿菌在模擬制粒時(shí)，蠟樣芽孢桿菌耐熱性最強(qiáng)；而 Guo等[26]在篩選芽孢桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，6株芽孢桿菌中有5株對模擬胃液表現(xiàn)出良好的耐性；賀永明[27]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌的芽孢衣可以維持芽孢膜的表面張力，使芽孢桿菌對膽鹽表現(xiàn)出較強(qiáng)抗性。以上試驗(yàn)結(jié)果均說明，芽孢桿菌具有良好的耐受性，這與本研究結(jié)果一致。蠟狀芽孢桿菌常處于孢子和休眠狀態(tài)下，具有耐高溫、耐酸堿、耐擠壓等特點(diǎn)，因此，可在飼料中長期存在[28]，且飼料中蠟狀芽孢桿菌的孢子進(jìn)入腸道后，能迅速在腸道上部復(fù)活，且復(fù)活率高達(dá)100%[29]，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的使用過程中均取得了明顯的效果[30]，是中國正式批準(zhǔn)生產(chǎn)微生態(tài)制劑的菌種之一。作為益生菌，安全無致病性是最重要的特性之一，因此，潛在益生菌在投入實(shí)際生產(chǎn)和使用前，必須對菌株的安全性做出準(zhǔn)確的評價(jià)[31]。本研究中，通過急性毒性試驗(yàn)檢測，HJJ-1菌株對黃金鯽未顯示毒性，安全性良好?？梢钥紤]將其作為飼料添加劑替代激素、抗生素和防腐劑。

4 結(jié)論

1)本研究從黃金鯽腸道中共分離出 5 株具有產(chǎn)酶能力的細(xì)菌，其中菌株HJJ-1 產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力較強(qiáng)，體外抑菌能力良好，且對多種藥物敏感，攜帶耐藥因子較少，經(jīng)鑒定HJJ-1為蠟狀芽孢桿菌。

2)HJJ-1在耐高溫、耐酸性、耐胃液、耐腸液、耐膽鹽試驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的耐受性。

3)HJJ-1可黏附于黃金鯽腸道黏液蛋白上，且安全性良好，具有潛在的益生特性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研制水產(chǎn)類微生態(tài)制劑提供了優(yōu)良的益生菌菌種參考。