涂 楓，王 麗，方曉敏，付言峰，任守文

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014）

精液冷凍保存技術(shù)指利用干冰、液氮、液氦等制冷劑作為冷源，將新鮮精液離心濃縮后用保護(hù)劑稀釋和降溫平衡，最后冷凍保存。冷凍精液可以使精子的絕大部分活動(dòng)暫停，待解凍復(fù)蘇后恢復(fù)精子的受精能力，使精液可以達(dá)到長(zhǎng)期保存和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)哪康腫1]。豬精液冷凍保存技術(shù)可以提高優(yōu)良種公豬的利用率，也可用來(lái)保護(hù)我國(guó)地方豬種的遺傳資源，但豬冷凍精液與其他家畜相比，其冷凍后的精子活力低且成本高。而作為多胎家畜，精子活力、精子質(zhì)膜及頂體的完整性、受胎率和窩產(chǎn)仔數(shù)是評(píng)價(jià)豬冷凍精液效果的主要指標(biāo)[2]。影響豬精液冷凍效果的因素很多，如公豬品種及個(gè)體的差異、稀釋液成分與稀釋比例、添加劑、pH、降溫程序、平衡時(shí)間和解凍方式等，豬冷凍精液生產(chǎn)仍存在諸多待優(yōu)化改進(jìn)的環(huán)節(jié)。文章以細(xì)管冷凍為例對(duì)豬冷凍精液生產(chǎn)、應(yīng)用及前景做綜合性闡述，以期為豬場(chǎng)實(shí)際生產(chǎn)提供借鑒。

1 豬冷凍精液的制作及保存

豬冷凍精液的制作主要有粒狀、細(xì)管、袋裝和安瓿瓶四種形式，各形式冷凍精液對(duì)母豬的分娩率和窩產(chǎn)仔數(shù)無(wú)顯著差異，其中以細(xì)管豬冷凍精液最常用，解凍方法便捷，且0.25 mL和0.5 mL細(xì)管制作的冷凍精液，解凍后的精子活力顯著高于5 mL細(xì)管冷凍效果，目前在養(yǎng)豬業(yè)應(yīng)用廣泛[2]。

豬冷凍精液生產(chǎn)包括精液采集、精液預(yù)處理、精液稀釋及冷凍保存等環(huán)節(jié)。目前并沒(méi)有統(tǒng)一的精液冷凍程序，生產(chǎn)中以改進(jìn)后的Westendorf設(shè)計(jì)法應(yīng)用較多。

1.1 精液采集

豬原精液質(zhì)量直接影響受精的效果，經(jīng)過(guò)冷凍后精子會(huì)受到損傷，進(jìn)一步影響冷凍精液的受精效果。精液品質(zhì)評(píng)定的最終標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)際受胎率、分娩率、產(chǎn)仔數(shù)等，但這些指標(biāo)測(cè)定耗時(shí)長(zhǎng)，實(shí)際生產(chǎn)中會(huì)使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行常規(guī)的精子評(píng)價(jià)指標(biāo)檢測(cè)，包括精子密度、數(shù)量、畸形率、活率等。因此，為保證豬冷凍精液的使用效果，新鮮的精液被采集后需進(jìn)行精液品質(zhì)評(píng)定，選取精子活率大于0.7，精子畸形率小于18%，密度達(dá)到3.0×109spz/mL（每毫升含30億個(gè)精子）的精液進(jìn)行細(xì)管冷凍精液的制作[2]。

1.2 精液預(yù)處理

新鮮精液室溫采集后用BTS稀釋液按比例等溫稀釋?zhuān)缓笾糜?5～17 ℃恒溫冰箱平衡1～4 h，據(jù)需運(yùn)輸時(shí)間和氣溫而定，運(yùn)輸時(shí)間越長(zhǎng)，氣溫溫度越高，平衡時(shí)間越長(zhǎng)。運(yùn)輸時(shí)間盡量避免過(guò)長(zhǎng)，建議一般不要超過(guò)2 h，同時(shí)應(yīng)避免光照和劇烈震動(dòng)。

豬的精子對(duì)溫度敏感，且精液量較大，豬精液采集后精子活力會(huì)迅速下降，冷凍前除去大部分精漿可以減少精子的死亡率[3]，可在15～17 ℃條件下，以離心力800 g離心8～10 min后去除部分上清。

1.3 精液的稀釋

精液中的精子在冷凍過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，存在滲透壓發(fā)生變化、細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成以及冷凍過(guò)程中水分通過(guò)細(xì)胞膜時(shí)對(duì)膜的影響等[4-6]。在精液冷凍過(guò)程中，可通過(guò)在稀釋液中添加蛋白或脂蛋白如卵黃、牛乳和酪蛋白提高精子的抗冷休克能力，并添加檸檬酸鈉、EDTA和Tris等降低脂類(lèi)的過(guò)氧化物反應(yīng)，從而維持精子在體外保存的存活率[7]。在此基礎(chǔ)之上添加其他成分，如咖啡因、氨基多糖類(lèi)、己酮可可堿、生殖激素和維生素等，稀釋液的種類(lèi)豐富，功能各有不同，但都會(huì)在不同程上度提高精子冷凍后的品質(zhì)[8-11]。

精液的稀釋主要是一次和二次稀釋法，一次稀釋法是使精子不經(jīng)過(guò)適應(yīng)階段就與甘油接觸，這樣會(huì)對(duì)精子頂體造成損傷；為了減輕對(duì)精子的損傷，一般采用二次稀釋法進(jìn)行精液稀釋。精液的稀釋?xiě)?yīng)該按照比例進(jìn)行，精液稀釋倍數(shù)過(guò)小，精子密度偏大，那么平均下來(lái)貯存過(guò)程中供給精子的養(yǎng)分偏少；而稀釋倍數(shù)過(guò)大，則使用時(shí)有效精子數(shù)量和精子活力降低，會(huì)影響母豬繁殖性能[12]。

將預(yù)處理的精液在15～17 ℃平衡后，在等溫條件下加入一定比例不含甘油的冷凍稀釋液I，使溫度緩慢降至 4～5 ℃，一般速度為90～120 ℃/min，平衡2 h左右，再加入含有甘油的冷凍稀釋液Ⅱ，甘油的終濃度在2%～4%的冷凍效果最好，一般為3%[13]。

1.4 豬冷凍精液的保存

豬精液冷凍處理過(guò)程對(duì)精液品質(zhì)影響極大，其中，豬精液的冷凍速率對(duì)精子可以安全通過(guò)-60～0 ℃的低溫區(qū)域，以及保障解凍后的精子活力至關(guān)重要。豬精液冷凍保存的冷源材料主要有干冰、液氮和液氦，目前最常用的是液氮[14]。用冷凍液稀釋處理后的精液分裝到細(xì)管中，用聚乙烯粉快速封閉管口，再將細(xì)管置于冷凍支架上，于0～4 ℃平衡1 min后，置于裝有液氮的帶蓋器皿中約20 min，使細(xì)管精液徹底冷凍后，移入液氮罐中保存。

2 豬冷凍精液的解凍及使用

2.1 精液解凍及精子活力評(píng)定

冷凍精液在解凍過(guò)程中，會(huì)經(jīng)過(guò)冰晶化的溫度區(qū)域，合適的解凍程序可以減輕精子在此時(shí)的受損程度。一般合適的解凍溫度為35～40 ℃或50～70 ℃，根據(jù)細(xì)管容量的大小，設(shè)置不同的解凍溫度和時(shí)間，如研究表明，0.25 mL細(xì)管的冷凍精液經(jīng)70 ℃水浴8 s或39 ℃水浴30 s效果較好[15]；0.5 mL細(xì)管的冷凍精液經(jīng)37 ℃水浴30 s或者57 ℃水浴10 s或者62 ℃水浴5 s效果較好[16]；而5 mL細(xì)管的冷凍精液經(jīng)52 ℃水浴35 s效果較好[17]。

解凍后精液品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要是精子活率和活力，將細(xì)管冷凍精液解凍后，剪開(kāi)細(xì)管的收尾，擠出1～2滴進(jìn)行顯微鏡鏡檢，觀察精子以直線運(yùn)動(dòng)的百分?jǐn)?shù)，等級(jí)評(píng)定在0.3以上的予以使用[18]。此外，若需要全面地評(píng)價(jià)精子的質(zhì)量，可以檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)，包括精子密度、pH、質(zhì)膜完整性、頂體完整性、精子獲能狀態(tài)、精子畸形率、精子存活時(shí)間、精子線粒體功能、精子與透明帶的結(jié)合能力、卵母細(xì)胞穿透能力和體外受精能力等[19]。

2.2 人工授精

豬冷凍精液采取子宮角深部輸精效果較好。普通的授精方法只是將輸精管送到子宮頸，而子宮角深部輸精則是先利用普通輸精的方式將輸精管大頭插入到母豬子宮頸，再將輸精管內(nèi)部小管緩慢深入子宮內(nèi)部，然后連接輸精瓶進(jìn)行輸精。子宮角深部輸精可以將輸精管送到子宮內(nèi)部使精液直接進(jìn)入子宮內(nèi)，精子需要游動(dòng)的距離更短，可以提高冷凍精液的利用效率和受精效果，成為更加合適的輸精方法[20,21]。為了保證授精效果，可在母豬發(fā)情期進(jìn)行多次輸精，每頭母豬每次使用10支左右0.5 mL細(xì)管的冷凍精液，將冷凍精液與等溫平衡的稀釋液混合后進(jìn)行深部輸精[22]。

3 豬冷凍精液的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景

現(xiàn)階段豬冷凍精液的應(yīng)用主要是種質(zhì)資源的保護(hù)及利用，使優(yōu)秀遺傳資源克服時(shí)空的限制；利用冷凍精液取代活體引種，降低運(yùn)輸、管理等成本，生物安全性高，便于疫情疾病的防控；加快模式動(dòng)物胚胎相關(guān)研究的進(jìn)展。

我國(guó)地方豬種因肉質(zhì)佳、產(chǎn)仔數(shù)高及抗逆性好，為世界養(yǎng)豬業(yè)做出了重要貢獻(xiàn)。為加強(qiáng)畜禽遺傳資源保護(hù)和利用，促進(jìn)現(xiàn)代畜牧業(yè)健康可持續(xù)的發(fā)展，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定了關(guān)于地方豬種遺傳資源保存方案，利用冷凍精液保種技術(shù)已收集到25萬(wàn)份冷凍精液，特別是在疫情防控階段，冷凍精液技術(shù)的應(yīng)用加快了地方豬種質(zhì)資源的保存和利用[23,24]。

我國(guó)在非洲豬瘟防控階段推行跨省禁運(yùn)和省內(nèi)堵卡點(diǎn)設(shè)置，使本就受限制的活體引種更加困難，豬場(chǎng)通常采取不引種的自繁自養(yǎng)策略，不僅降低了豬群的整體質(zhì)量，還會(huì)造成種豬場(chǎng)生產(chǎn)規(guī)模的縮減，嚴(yán)重限制養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[25]。冷凍精液的使用可以緩解豬場(chǎng)引種困難的問(wèn)題，且冷凍精液生產(chǎn)過(guò)程中，進(jìn)行精清分離的同時(shí)可將精液中的病毒去除，精液冷凍后可存放的時(shí)間增長(zhǎng)，便于在病毒潛伏期給予公豬更長(zhǎng)時(shí)間的健康狀態(tài)觀察。常溫精液保存時(shí)間一般不超過(guò)7 d，而非洲豬瘟病毒的潛伏期可達(dá)21 d甚至更久[26]。因此，在疫病防控情況下，冷凍精液較常溫精液成為更合適的引種和保種方式。

隨著豬人工授精技術(shù)的提高和繁殖新技術(shù)的運(yùn)用，冷凍精液的受胎率得到提升。豬作為人類(lèi)疾病研究的模式動(dòng)物，與豬胚胎相關(guān)的科學(xué)研究得到了迅速地發(fā)展，豬早期胚胎主要是通過(guò)新鮮精液或冷凍精液進(jìn)行體外受精獲得。冷凍精液較新鮮精液運(yùn)輸更方便，但其體外受精率較低。隨著單精注射技術(shù)的成熟，卵母細(xì)胞質(zhì)注射冷凍后精子得到的總囊胚率較新鮮精液體外受精率高[27]，冷凍精液在科研上的使用將會(huì)得到進(jìn)一步擴(kuò)展。