李 桃,汪軍成,姚立蓉,李葆春,馬小樂, 楊 柯,司二靜,尚勛武,王化俊,孟亞雄

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070; 2.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì) 創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070; 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

栽培大麥(HordeumvulgareL.)是隸屬禾本科的一年生作物，主要用途是飼用、啤酒釀造及食品加工等。由子囊菌亞門真菌網(wǎng)斑病菌(Pyrenophorateres，Ascomycotina)引起的大麥網(wǎng)斑病在國(guó)內(nèi)大麥主要產(chǎn)區(qū)開始流行，并有逐年加重的趨勢(shì)[1-2],其在世界其他國(guó)家如澳大利亞[3]、新西蘭和丹麥[4]、南非[5]、美國(guó)[6]等地也均有發(fā)生。網(wǎng)斑病可抑制大麥生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成大麥減產(chǎn)、品質(zhì)變劣，甚至?xí)斐山^收，是限制大麥生產(chǎn)的主要原因之一。為解決網(wǎng)斑病對(duì)大麥的危害，大麥抗網(wǎng)斑病機(jī)制研究成為近年來被關(guān)注的重點(diǎn)，而通過基因組學(xué)方法鑒定和分離新基因是研究大麥抗病機(jī)制的有效方法之一。

有關(guān)大麥抗病基因分離和鑒定的報(bào)道并不多，且大多與大麥抗逆境脅迫有關(guān)，如HvNAC1[8]、Mlo[9]、ICS和PAL[10]等家族的基因。黃德華等[7]證實(shí)了大麥GER4基因簇的啟動(dòng)子表達(dá)與白粉病真菌病原體攻擊有關(guān)，但有關(guān)大麥抗真菌類病害基因的研究并不多見。大麥基因組測(cè)序的完成[11]以及高通量測(cè)序技術(shù)的日益成熟，對(duì)大麥抗病基因的深入研究提供了方便。

植物的抗逆境脅迫不僅受多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控，還受多個(gè)基因協(xié)同表達(dá)和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[12]。有研究表明，與差異表達(dá)基因趨勢(shì)相同的蛋白大多與植物抗逆相關(guān)；乙烯、赤霉素、苯丙烷類代謝參與甘蔗黑穗病侵染的響應(yīng)過程[13]。因此，掌握關(guān)鍵基因的調(diào)控機(jī)制是實(shí)現(xiàn)促進(jìn)多基因表達(dá)以提高植物綜合抗病性的有效途徑。研究發(fā)現(xiàn)，次生代謝產(chǎn)物[14]、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[15]、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)[16]、鞘脂[17]等代謝途徑在植物的抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，如NAC[8]、NF-Y[18]、HD-Zip[19-20]和WRKY[21]等家族的基因。為了解已知抗逆境基因是否與抗網(wǎng)斑病有關(guān)，本研究擬比較抗性和敏感型大麥材料對(duì)網(wǎng)斑病侵染后響應(yīng)基因的表達(dá)特性，并通過比較其轉(zhuǎn)錄組(RNA-sep)探索大麥中有關(guān)抗病代謝途徑，以期獲得與抗病性有關(guān)的基因，了解大麥對(duì)網(wǎng)斑病菌侵染的響應(yīng)機(jī)制，為大麥抗網(wǎng)斑病的進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及設(shè)計(jì)

由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類課題組提供抗病材料BYT-CYA3(B)和敏感型材料美41/I(M)。種子用72%乙醇處理 15 s，10%次氯酸鈉處理 10 min，用蒸餾水沖洗6次后，置于鋪有雙層無菌濾紙的無菌培養(yǎng)皿里發(fā)芽，噴霧保持濾紙濕潤(rùn)；一周后，將發(fā)芽種子移栽入花盆。每盆種植5 株，每個(gè)品種共30盆。待幼苗長(zhǎng)至兩葉一芯期，對(duì)25盆大麥噴施由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)麥類課題組提供的活化網(wǎng)斑病病原菌菌株(LQA)懸浮液(濃度約106·mL-1)，其余5盆為空白對(duì)照。接菌完成后置于21 ℃黑暗培養(yǎng)，于0、3、6、12、24和72 h后分別剪取接菌組與對(duì)照組葉片3～5 g，液氮速凍，于 -80 ℃保存?zhèn)溆谩?次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 RNA提取和cDNA 文庫(kù)構(gòu)建

采用Plant RNA Kit試劑盒(OMEGA，中國(guó)上海)按照說明提取大麥葉片總的RNA。在RNA樣品中加DNaseI于 37 ℃水浴30 min，防止DNA污染。用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度。按照試劑盒說明富集mRNA和去除rRNA；用DNA探針雜交rRNA，再用RNaseH和DNaseI純化RNA；用打斷buffer使RNA片段化；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，組建cDNA文庫(kù)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和數(shù)據(jù)過濾

在BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)對(duì)構(gòu)建好的cDNA文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序，所有測(cè)序工作由華大基因生物公司(深圳)完成。

測(cè)序所得的數(shù)據(jù)為原始數(shù)據(jù)(raw reads)。使用在線的SOAPnuke軟件(https://github.com/BGI-flexlab/SOAPnuke)過濾原始數(shù)據(jù)，去除接頭污染、未知堿基N過高的reads和質(zhì)量低的reads，獲得clean reads。利用在線軟件HISAT(Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts)將clean reads與大麥參考基因組序列IBSC_PGSB_v2.39進(jìn)行比對(duì)。使用 Bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/Bowtie2/index.shtml)將clean reads比對(duì)到參考基因序列得到比對(duì)結(jié)果[22]，對(duì)比對(duì)結(jié)果使用RSEM(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/rsem-calculate-expression.html)[23]計(jì)算差異表達(dá)基因。分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，包括轉(zhuǎn)錄本的覆蓋度及分布。

1.4 基因的功能注釋

將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定到的所有基因合并為一個(gè)基因集數(shù)據(jù)庫(kù)，使用getorf檢測(cè)所有基因的 ORF；使用hmmsearch將ORF與轉(zhuǎn)錄因子蛋白結(jié)構(gòu)域(數(shù)據(jù)來源于TF)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)(PlantTFDB)描述的轉(zhuǎn)錄因子家族特征對(duì)所有基因進(jìn)行功能鑒定。使用HMMER程序的 hmmpfam與Pfam 23.0對(duì)轉(zhuǎn)錄因子與PlantTFDB進(jìn)行比對(duì)，搜索蛋白結(jié)構(gòu)域以鑒定編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因，使用DIAMOND(https://github.com/bbuchfink/diamond)軟件將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定的所有基因比對(duì)至植物抗病基因數(shù)據(jù)庫(kù)(plant resistance gene database，PRGdb)進(jìn)行注釋，依據(jù)比對(duì)覆蓋度(query coverage)和一致性(identity)等條件對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行篩選。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG功能注釋富集分析(Wiki https://en.wikipedia.org/wiki/Hypergeometric_distribution)。本研究的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)可以從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲取，登陸號(hào)SUB6851949。

1.5 網(wǎng)斑菌侵染大麥葉片響應(yīng)的差異表達(dá)基因的鑒定和qRT-PCR驗(yàn)證

試驗(yàn)以接菌后0 h樣品為對(duì)照(B-CK，M-CK)，比較抗病和敏感型材料接種不同時(shí)間的樣品(B-3h，M-3h，B-6h，M-6h，B-12h，M-12h，B-24h，M-24h，B-72h，M-72h)與相應(yīng)對(duì)照材料基因的表達(dá)水平,參照Audic等[24]的方法，進(jìn)行基因表達(dá)量分析，滿足錯(cuò)配率[25](false discovery rate，F(xiàn)DR) ≤0.001且表達(dá)差異在2倍以上的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。

利用Primer-NCBI在線設(shè)計(jì)軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/#)設(shè)計(jì)引物(表1)，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證分析。將樣品3次生物學(xué)重復(fù)的 RNA 采用第1鏈cDNA合成試劑盒(TIANGEN，中國(guó)北京)按照說明合成反轉(zhuǎn)錄cDNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以大麥Actin為內(nèi)參，采用SYBR Green RT-PCR 試劑盒(TIANGEN)，按照說明使用ABI 7500 Real Time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，結(jié)果按照2-ΔΔCT計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量評(píng)估

為了研究大麥在不同時(shí)間段響應(yīng)網(wǎng)斑病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化特征，采集大麥接菌處理0 h、3 h、6 h、12 h、24 h和72 h的幼苗葉片，提取總RNA，構(gòu)建了12個(gè)cDNA文庫(kù)，用BGISEQ-500平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序，平均每個(gè)文庫(kù)測(cè)序產(chǎn)生10.63 Gb的數(shù)據(jù)，共獲得1 401 716 667個(gè)raw reads，去除含接頭的reads、未知堿基N含量大于5%的reads和低質(zhì)量的reads，共得到 127 601 667條clean reads，過濾后12個(gè)cDNA文庫(kù)的clean reads占raw reads的比例均在80%以上；clean reads的Q20比率均在97%以上，其 Q30比率均在86%以上，每個(gè)文庫(kù)clean reads數(shù)均在101.61×106條以上(表2)，獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)與質(zhì)量符合下一步分析要求。

樣品比對(duì)到基因組的平均比對(duì)率為 87.61%，比對(duì)到基因集的平均比對(duì)率為 74.93%；共檢測(cè)到基因數(shù)為35 545個(gè)，其中已知基因30 030個(gè)，新基因?yàn)? 515個(gè)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的引物Table 1 Primers for real-time quantitative PCR

表2 供試材料Reads 的質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 2 Quality statistics of transcriptome sequencing after filtering

2.2 基因注釋分析

對(duì)檢測(cè)到的30 030個(gè)已知基因進(jìn)行功能注釋分析，發(fā)現(xiàn)只有1 977個(gè)基因在TF數(shù)據(jù)庫(kù)有注釋，可歸類到58個(gè)基因家族，注釋到基因數(shù)最多的是MYB家族(228)，其次是AP2-EREBP(170)、bHLH(157)、FAR1(146)、NAC(145)、ABI3VP1(125)和WRKY家族(107)，注釋到基因數(shù)最少的有CAMTA(1)、HRT(1)、S1Fa-like(1)(圖1 A)。在PRGdb數(shù)據(jù)庫(kù)中，有3 427個(gè)基因被注釋到13個(gè)結(jié)構(gòu)域中，其中注釋到RLP結(jié)構(gòu)域中的基因數(shù)目最多，其次是NL、CNL、N和TNL，注釋到的基因數(shù)分別有789、508、449和352個(gè)，注釋到的基因數(shù)目最少的結(jié)構(gòu)域是TNL-OT(圖1 B)。

A：在TF數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果；B：在 PRGdb數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)結(jié)果。

2.3 網(wǎng)斑病菌侵染后差異表達(dá)基因(DEGs)分析

與網(wǎng)斑病菌侵染大麥0 h處理對(duì)照相比，在網(wǎng)斑病菌侵染大麥3 h、6 h、12 h、24 h和72 h后，抗病材料中分別有9 842、12 073、9 065、4 674和5 939個(gè)差異表達(dá)基因；敏感型材料中分別有10 149、11 322、11 142、2 305和5 023個(gè)差異表達(dá)基因。隨著侵染時(shí)間的持續(xù)，抗病材料與敏感型材料上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因(DEGs)數(shù)整體呈先增后減的趨勢(shì)。抗病材料中的上調(diào)差異表達(dá)基因數(shù)目均大于敏感型材料(圖2)。

2.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因在2種材料不同階段的GO富集結(jié)果相似。在生物過程(biological process)中，差異表達(dá)基因主要富集的條目有生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生(cellular component organization or biogenesis)、細(xì)胞過程(cellular process)、定位(localization)、代謝過程(metabolic process)、對(duì)刺激的反應(yīng)(response to stimulus)。在細(xì)胞組分(cellular component)中，差異表達(dá)基因主要富集的條目為細(xì)胞(cell)、大分子復(fù)合物(macromolecular complex)、細(xì)胞膜(membrane)、細(xì)胞膜片段(membrane part)、細(xì)胞器(organelle)、細(xì)胞器的部分(organelle part)。在分子功能(molecular function)中，差異表達(dá)基因主要富集的條目有整合(binding)、催化活力(catalytic activity)、轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)(transporter activity)。

在抗病材料BYT-CYA3中，網(wǎng)斑病菌侵染大麥接觸階段到侵入階段(接種3～6 h)，富集到生物過程(biological_process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能條目中的差異表達(dá)基因數(shù)目均明顯增加；在網(wǎng)斑病菌侵染的擴(kuò)展階段(接種12～24 h)，富集到生物過程(biological_process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能條目中的差異表達(dá)基因數(shù)目較侵入階段均驟減；而在大麥發(fā)病階段(接種72 h)，與擴(kuò)展階段相比，富集到生物過程(biological_process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能條目中的差異表達(dá)基因數(shù)目均明顯增加。在敏感型材料美41/I中，從網(wǎng)斑病菌侵染大麥到擴(kuò)展前期階段(3～12 h)，富集到生物過程(biological_process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能條目中的差異表達(dá)基因數(shù)目沒有明顯變化；而從擴(kuò)展后期到發(fā)病階段，富集到生物過程(biological_process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能條目中的差異表達(dá)基因數(shù)目均明顯減少。

圖2 不同時(shí)間的差異表達(dá)基因數(shù)Fig.2 Number of differentially expressed genes at different time

在網(wǎng)斑病菌侵染的接觸階段(3 h)，抗病材料中富集到生物過程(biological_process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能條目中的差異表達(dá)基因數(shù)目明顯少于敏感型材料，其中，最為明顯的條目有細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生(cellular component organization or biogenesis)和細(xì)胞(cell)。在網(wǎng)斑病菌侵入階段，抗病材料中富集到生物過程(biological_process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能條目中的差異表達(dá)基因數(shù)目明顯多于敏感型材料，最為明顯的條目有細(xì)胞成分組織或生物發(fā)生(cellular component organization or biogenesis)、細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)、細(xì)胞(cell)、細(xì)胞器(organelle)、細(xì)胞器的部分(organelle part)、整合(binding)、催化活力(catalytic activity)。在網(wǎng)斑病菌侵染大麥的擴(kuò)展階段(12～24 h)，抗病材料中富集到生物過程(biological_process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能條目中的差異表達(dá)基因數(shù)目明顯少于敏感型材料，最為明顯的條目有生物調(diào)節(jié)(biological regulation)、代謝過程(metabolic process)、細(xì)胞(cell)和整合(binding)；在大麥發(fā)病階段(72 h)，抗病材料中富集到生物過程(biological_process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)三大功能條目中的差異表達(dá)基因數(shù)目均明顯多于敏感型材料。

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

通過KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因在2種材料的不同階段的KEGG富集結(jié)果比較相似。差異表達(dá)基因主要富集在12條通路上，即環(huán)境適應(yīng)(environmental adaptation)、核苷酸代謝(nucleotide metabolism)、脂質(zhì)代謝(lipid metabolism)、全球概覽地圖(global and overview maps)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、遺傳翻譯(translation)、轉(zhuǎn)錄(transcription)、折疊、分類和降解(folding,sorting and degradation)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、運(yùn)輸和分解代謝(transport and catabolism)(圖3)。

在抗病材料BYT-CYA3中，從網(wǎng)斑病菌侵染大麥接觸階段到侵入階段(3～6 h)，富集到各代謝通路上的差異表達(dá)基因數(shù)目均明顯增加，最明顯的通路有全球概覽地圖(global and overview maps)、碳水化合物代謝(carbohydrate metabolism)、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)、氨基酸代謝(amino acid metabolism)、遺傳翻譯(translation)、轉(zhuǎn)錄(transcription)、折疊、分類和降解(folding,sorting and degradation)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、運(yùn)輸和分解代謝(transport and catabolism)；在網(wǎng)斑病菌侵染的擴(kuò)展階段(12～24 h)，富集到各代謝通路上的差異表達(dá)基因的數(shù)目較侵入階段均劇減；而在大麥的發(fā)病階段(72 h)，與擴(kuò)展階段相比，富集到各代謝通路上的差異表達(dá)基因數(shù)目均明顯增加(圖3 A)。在敏感型材料美41/I中，從網(wǎng)斑病菌侵染大麥接觸階段到侵入階段(3 ～6 h)，發(fā)現(xiàn)富集到各代謝通路上的差異表達(dá)基因數(shù)目均明顯增加；而網(wǎng)斑病菌侵染的擴(kuò)展階段到大麥發(fā)病(12～72 h)，富集到各代謝通路上的差異表達(dá)基因數(shù)目均較前階段明顯減少(圖3 B)。

在網(wǎng)斑病菌侵染大麥的接觸階段(3 h)，抗病材料中富集到各代謝通路上的差異表達(dá)基因多于敏感型材料，差異較大的代謝通路有轉(zhuǎn)錄(transcription)和全球概覽地圖(global and overview maps)；從網(wǎng)斑病菌侵染大麥侵入階段到擴(kuò)展階段(6～24 h)，抗病材料和敏感型材料富集到各代謝通路上的差異表達(dá)基因數(shù)目均不斷減少；在大麥發(fā)病階段(72 h)，抗病材料中富集到各代謝通路上的差異表達(dá)基因多于敏感型材料，差異較大的代謝通路有轉(zhuǎn)錄(transcription)和全球概覽地圖(global and overview maps)(圖3)。

2.6 差異表達(dá)基因功能分析

在抗病材料中，共獲得差異表達(dá)基因435個(gè)(圖4A)。對(duì)435個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG途徑富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因較多的通路有代謝途徑(metabolic pathways；ko01100)、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑-植物(MAPK signaling pathway-plant；ko04016)、植物-病原體相互作用(plant-pathogen ；ko04626)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction；ko04075)和次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites；ko01110)(圖4B)。其中有19.77%的差異表達(dá)差因基因通路產(chǎn)物是白介素-1受體相關(guān)激酶(interleukin-1 receptor-associated kinase)(圖4B)。對(duì)435個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO途徑富集分析，在生物過程(biological_process)中，差異表達(dá)基因主要富集的條目有細(xì)胞過程(cellular process)、代謝過程(metabolic process)。細(xì)胞組分(cellular component)中，主要富集的條目為細(xì)胞(cell)、細(xì)胞器(membrane)、細(xì)胞器的部分(membrane part)。在分子功能(molecular function)中，主要富集的條目為整合(binding)和催化活力(catalytic activity)(圖4C)。推測(cè)這幾條代謝通路與大麥抗病性有關(guān)。

為了分析差異表達(dá)基因的表達(dá)模式，對(duì)182個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG和GO途徑分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在過氧化物酶體(peroxisome；ko04146)、代謝途徑(metabolic pathways；ko01100)、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑-植物(MAPK signaling pathway - plant；ko04016)、植物-病原體相互作用(plant-pathogen；ko04626)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction；ko04075)、代謝途徑(biosynthesis of secondary metabolites；ko01110)。根據(jù)182個(gè)差異表達(dá)基因的功能在代謝通路上的定位，發(fā)現(xiàn)這些基因參與了維持細(xì)胞死亡的防御反應(yīng)、維持病原體入侵和維持植物防御中活性氧的積累(圖5B)。這182個(gè)差異基因可以作為大麥抗病基因進(jìn)一步研究的候選基因。

A：網(wǎng)斑病菌侵染抗病材料的差異表達(dá)基因韋恩圖分析；B：網(wǎng)斑病菌侵染抗病材料的差異表達(dá)基因的KEGG分類注釋；C：表示網(wǎng)斑病菌侵染抗病材料的差異表達(dá)基因的GO分類注釋。

灰框是通過轉(zhuǎn)錄組序列檢測(cè)到的KEGG酶編碼基因。

2.7 實(shí)時(shí)定量熒光PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，從篩選的182個(gè)抗病相關(guān)基因中選取信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)、MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑-植物(MAPK signaling pathway-plant)、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)和植物-病原體相互作用(plant-pathogen)代謝通路的10個(gè)基因(表1)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其網(wǎng)斑病菌侵染前后的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這10個(gè)基因的熒光定量與轉(zhuǎn)錄測(cè)序結(jié)果基本一致，且均上調(diào)表達(dá)。

3 討 論

有研究表明，植物在與病原微生物的長(zhǎng)期互作、協(xié)同進(jìn)化過程中逐漸形成一系列的防衛(wèi)機(jī)制，這些機(jī)制在誘導(dǎo)后才能快速、充分地表達(dá)，從組織結(jié)構(gòu)機(jī)制、生理機(jī)制和分子機(jī)制看，與脅迫相關(guān)的基因在病原微生物侵染后的不同階段具有不同的表達(dá)模式[26]。這現(xiàn)象可能是大麥調(diào)節(jié)體內(nèi)生理代謝，以形成相應(yīng)的防御機(jī)制。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大麥網(wǎng)斑病病菌侵染后無論是抗病材料還是敏感型材料，有大量不同家族的基因出現(xiàn)表達(dá)量的變化，兩種材料在不同侵染階段的差異表達(dá)基因的數(shù)目不同，這可能是其抗病性不同的根本原因。比較2個(gè)材料在網(wǎng)斑病菌侵染3 h、6 h、12 h、24 h和72 h后基因表達(dá)的異同，推測(cè)不同基因在網(wǎng)斑病菌侵染后，其轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控方式在不同階段存在差異。證明了王海波等[27]和翁 宇等[28]的研究結(jié)果：植物通過改變基因表達(dá)量來響應(yīng)脅迫。

抗病材料和敏感型材料在病菌侵染后的差異表達(dá)基因有所相同，這表明不同抗病材料對(duì)逆境的響應(yīng)機(jī)制不同。錢 前等[29]提出，植物有天然免疫抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，即便在相同時(shí)間2個(gè)材料中存在的共同差異表達(dá)基因，其上調(diào)、下調(diào)表達(dá)程度也存在差異，推測(cè)這可能與大麥的基礎(chǔ)抗性有關(guān)，同類型材料對(duì)相同脅迫有某種相同的響應(yīng)機(jī)制，但響應(yīng)程度不同。

本研究對(duì)差異表達(dá)基因做了PRGdb和TF注釋，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因大多富集在CNL、N、NL、RLP和TNL等結(jié)構(gòu)域中。有研究表明，富集在CNL、N、NL、RLP和TNL等結(jié)構(gòu)域的基因與植物防御系統(tǒng)的抗病性有關(guān)[30-31]。目前，在植物中發(fā)現(xiàn)的與抗病性有關(guān)的基因家族有b ZIP、AP2/EREBP、WRKY、MYB、NAC等[32]。本研究中，差異表達(dá)基因在AP2/EREBP、NAC、WRKY和bHLH家族中分布數(shù)目較多。植物中特有轉(zhuǎn)錄因子家族是NAC，其參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)和，調(diào)控植物的抗病性[33-35]。王立國(guó)等[36]、董 帥等[8]和張立全等[37]完成了在陸地棉、大麥、黃花苜蓿中對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因的克隆。證明了NAC參與調(diào)控植物的抗逆性。除了NAC，植物中還有一種特有的家族是鋅指蛋家族WRKY。研究發(fā)現(xiàn)，WRKY類轉(zhuǎn)錄因子參與植物的形態(tài)發(fā)育與對(duì)病原體的防御響應(yīng)[38]。目前，已有對(duì)WRKY基因的分析和結(jié)構(gòu)域特點(diǎn)及其生物學(xué)功能的研究[39-40]和其在植物防御反應(yīng)中的作用[41-42]方面的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，MYB家族被注釋到最多的基因數(shù)目。在植物中，MYB通過有效調(diào)控類黃酮物質(zhì)的生物合成以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗氧化、抗衰老及抵抗病毒能力[43]。已有研究表明，MYB與小麥對(duì)紋枯病、赤霉病抗性有關(guān)[44]。對(duì)于bHLH家族的研究表明，植物bHLH基因家族參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過程[45]。而對(duì)于AP2/EREBP家族的研究表明，在擬南芥中得到AP2/EREBP家族的獨(dú)特成員是At4g13040基因，其參與SA介導(dǎo)的疾病防御1-APD1的Apetala 2家族蛋白合成，使病原體接種后無法誘導(dǎo)表達(dá)[46]。

本研究篩選出來182個(gè)可能與大麥抗病性有關(guān)的基因，其中，35個(gè)差異表達(dá)基因參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(plant hormone signal transduction；ko04075)代謝途徑的基因(圖3B)，28個(gè)差異表達(dá)基因富集到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signal transduction)，其中有7個(gè)差異表達(dá)基因參與合成LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶FLS2(LRR receptor-like serine/threonine-protein kinase FLS2)(附表1)。苗麗麗等[47]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶2(SnRK2)是植物特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，SnRK2作為典型的多功能調(diào)節(jié)因子參與響應(yīng)各種逆境脅迫；郭艷玲等[14]提出次生代謝產(chǎn)物參與植物的抗病防御反應(yīng)，作為生化壁1壘防御病原物侵染，和信號(hào)物質(zhì)共同參與植物的抗病反應(yīng)。本研究中發(fā)現(xiàn),45個(gè)差異表達(dá)基因參與其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites)代謝途徑的基因，其中9個(gè)差異表達(dá)基因參與合成過氧過氧化物酶體(peroxidase；K00430)，而過氧化物酶是病原真菌抗氧化防御系統(tǒng)的主要組分[48]； 36個(gè)差異表達(dá)基因富集到環(huán)境適應(yīng)(environmental adaptation)，其中5個(gè)差異表達(dá)基因是抗病蛋白R(shí)PM1(disease resistance protein RPM1)，8個(gè)差異表達(dá)基因參與合成LRR受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶FLS2(LRR receptor-like serine/threonine-protein kinase FLS2)。這些基因的結(jié)構(gòu)與功能需要更多試驗(yàn)與探究。

本試驗(yàn)從分子水平上初步探索了大麥對(duì)網(wǎng)斑病侵染的響應(yīng)機(jī)制，提供了抗病基因深入研究的候選基因，為大麥抗病基因的研究奠定基礎(chǔ)。