胡澤斌，高飛，孫彬裕，孫楠，楊振，黃杰

·技術(shù)與方法·

人淋巴細(xì)胞國家參考品的協(xié)作標(biāo)定

胡澤斌*，高飛*，孫彬裕，孫楠，楊振，黃杰

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所

根據(jù)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) WS/T 360-2011《流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》[1]以及業(yè)內(nèi)共識(shí)，通常使用白細(xì)胞分化抗原 CD45/CD4/CD8/CD3/CD19/CD16 和（或）CD56 單一檢測試劑或組合亞群檢測試劑（流式細(xì)胞法），通過流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血或骨髓細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原（CD）表達(dá)，來分析不同亞群淋巴細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)和百分比[2-4]。CD45+用于鑒別白細(xì)胞，在所有白細(xì)胞上都有表達(dá)，稱為白細(xì)胞共同抗原，CD3+用于鑒別成熟 T 淋巴細(xì)胞，CD3+CD4+雙陽用于鑒別 T 淋巴細(xì)胞中的輔助/誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞亞群，CD3+CD8+雙陽用于鑒別 T 淋巴細(xì)胞中的抑制/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞亞群。CD3-CD19+用于鑒別 B 淋巴細(xì)胞，CD3-CD16+和（或）CD56+用于鑒別自然殺傷細(xì)胞（NK 細(xì)胞）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是具有準(zhǔn)確量值的一種或多種足夠均勻且穩(wěn)定特性的材料，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量賦值的過程[5-7]。一般有以下四種定值方式可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。①用高準(zhǔn)確度的絕對(duì)測量方法定值，如參考測量程序和方法；②采用兩種以上不同原理的已知準(zhǔn)確度的可靠方法定值；③多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值，即協(xié)作標(biāo)定；④使用已有的一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)正在研制的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較定值。本單位研制的人淋巴細(xì)胞國家參考品，預(yù)期用途是評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑的準(zhǔn)確性。而目前尚無絕對(duì)測量方法對(duì) CD45+/CD4+/CD8+/CD3+/CD19+/CD16+和（或）CD56+細(xì)胞亞群的絕對(duì)數(shù)量和百分比進(jìn)行定值，故采用公認(rèn)的流式細(xì)胞法，多家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定的方式對(duì)其進(jìn)行定值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 BD FACS Calibur 流式細(xì)胞儀由巴德生物科技有限公司提供；FACS Calibur 和 Canto II 流式細(xì)胞儀由 BD 公司提供；Beckman Coulter 流式細(xì)胞儀、Navios 流式細(xì)胞儀、DxFLEX 流式細(xì)胞儀由貝克曼庫爾特公司提供；ACEA Novocyte 流式細(xì)胞儀由艾森生物提供；Beckman Navios 流式細(xì)胞儀、BD Canto II 流式細(xì)胞儀由北京曠博生物技術(shù)股份有限公司提供；Bricyte E6 流式細(xì)胞儀由邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供。

1.1.2 試劑 商品化全血質(zhì)控品為美國 Beckman Coulter 和 IMMUNO-TROL Cells 以及 Statusflow 的產(chǎn)品；CD4+細(xì)胞國際質(zhì)控品為英國生物制品檢定所的質(zhì)控品；BD MultiTEST IMK Kit（淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒）和絕對(duì)計(jì)數(shù)管為美國 BD Biosciences 公司產(chǎn)品；4 色 TBNK 熒光單克隆抗體試劑盒和絕對(duì)計(jì)數(shù)微球?yàn)楸本┩鷷r(shí)代公司產(chǎn)品；CD45FITC/CD4PE/CD8ECD/CD3PC5 和 CD45FITC/ CD56PE/CD19ECD/CD3PC5 淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒以及 Flow Count 微球?yàn)槊绹?Beckman Coulter 公司產(chǎn)品；ACEA 的 4 色檢測試劑 CD3/CD8/CD45/CD4 和 CD3/ CD16+56/CD45/CD19 以及 ACEA 的 6 色檢測試劑 CD3/CD16+56/CD45/CD4/CD19/CD8 淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒為艾森生物公司產(chǎn)品；CD3/CD8/CD45/CD4 和 CD3/CD16+56/CD45/CD19 淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒為邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人淋巴細(xì)胞國家參考品協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)方案 選擇業(yè)界認(rèn)可度和知名度較高的具有良好實(shí)驗(yàn)條件的 6 家實(shí)驗(yàn)室作為合作單位，本單位負(fù)責(zé)制定實(shí)驗(yàn)方案并匯總統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。6 家實(shí)驗(yàn)室分別是貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司（Beckman）、碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司、北京曠博生物技術(shù)股份有限公司、邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司、艾森生物（杭州）有限公司、巴德生物科技有限公司。各實(shí)驗(yàn)室均需參照 WS/T 360-2011《流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》要求，使用國家藥品監(jiān)督管理局已批準(zhǔn)上市的淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑（流式細(xì)胞法）和絕對(duì)計(jì)數(shù)微球/管（流式細(xì)胞法），在不同的流式細(xì)胞儀平臺(tái)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析。

每家分發(fā) 3 ~ 5 支人淋巴細(xì)胞國家參考品候選品、1 支 CD4+細(xì)胞國際質(zhì)控品以及足量的用于復(fù)溶候選品和國際質(zhì)控品的純水，冰袋運(yùn)輸至各家實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)。企業(yè)收到郵寄的樣本如當(dāng)天不能實(shí)驗(yàn)，需放置冰箱（2 ~ 8 ℃）并在 5 d 內(nèi)完成檢測。每支候選品重復(fù)測試 2 次。

1.2.2 人淋巴細(xì)胞國家參考品的協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)操作 參考品為白色凍干粉，使用時(shí)應(yīng)先擰開黑色外瓶蓋，小心打開瓶口內(nèi)的膠塞（瓶塞），避免損失內(nèi)容物。加 1 ml 純水，將瓶塞蓋回，上下輕輕顛倒 3 ~ 5 次，室溫靜置 5 min 使所有內(nèi)容物完全復(fù)溶。復(fù)溶后立即使用。在絕對(duì)計(jì)數(shù)管底部加入 10 ~ 20 μl 熒光抗體試劑（按照各家試劑說明書用量），再加入 100 ~ 300 μl 充分混勻的復(fù)溶細(xì)胞懸液，在渦旋儀上輕輕混勻，置于室溫，避光反應(yīng) 20 ~ 30 min（按照試劑說明書建議）。每管補(bǔ)加 PBS 溶液至總體積 500 μl，混勻后，在各家流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測，細(xì)胞獲取數(shù)至少 1 萬個(gè)，以 CD45 陽性細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，分析 T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群的百分比和絕對(duì)計(jì)數(shù)。

同時(shí)，在不同的流式細(xì)胞儀平臺(tái)上檢測時(shí)，均需使用商品化全血質(zhì)控品或者 CD4+細(xì)胞國際質(zhì)控品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制[8-10]。

2 結(jié)果

2.1 協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

參考品共在 6 家合作單位的 7 個(gè)流式檢測平臺(tái)上進(jìn)行了檢測，使用了 6 種 T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群流式試劑。各家檢測時(shí)在每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下，均使用了商品化全血質(zhì)控品或者 CD4+細(xì)胞國際質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)控品淋巴細(xì)胞測得的絕對(duì)數(shù)和百分比均在其靶值范圍內(nèi)，表明各家實(shí)驗(yàn)操作成立，參考品的測得結(jié)果可信。對(duì)協(xié)作標(biāo)定結(jié)果進(jìn)行分析整理匯總，共獲得 11 組數(shù)據(jù)，詳見表 1 ~ 11。

表 1 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 1

表 2 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 2

表 3 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 3

表 4 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 4

表 5 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 5

表 6 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 6

表 7 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 7

表 8 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 8

表 9 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 9

表 10 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 10

表 11 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 11

2.2 剔除離群值

將以上 6 家標(biāo)定的 11 組 40 個(gè)平行數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，各家 T 和 B 淋巴細(xì)胞亞群百分比數(shù)值基本一致，NK 百分比差別較大，各家亞群細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)的數(shù)值也比較一致，僅其中一家公司標(biāo)定的細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量整體均偏低約 1 倍。將所有結(jié)果進(jìn)行匯總分析，求得各檢測指標(biāo)（CD45+的絕對(duì)數(shù)量，CD3+、CD4+、CD8+、CD19+、CD56+或 CD16+CD56+的百分比和絕對(duì)數(shù)量）的總平均值 M、標(biāo)準(zhǔn)差 SD（表 12）。采用 Grubbs 統(tǒng)計(jì)法，以 CD45+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的 M ± 2SD（1353 ~ 4037 個(gè)/μl）和 CD3+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的 M ± 2SD （1080~ 3112 個(gè)/μl）為依據(jù)來剔除離群值。該公司測得的 2 組 6 個(gè)平行數(shù)據(jù)中（表 10 和 11）的 4 個(gè)均低于 M-2SD，因此作為離群值剔除其所有數(shù)據(jù)，而其他 5 家9 組數(shù)據(jù)（表 1 ~ 9）保留，作為協(xié)作標(biāo)定的合理有效數(shù)據(jù)進(jìn)行定值。

表 12 11 組原始數(shù)據(jù)的總平均值 M、標(biāo)準(zhǔn)差 SD

表 13 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量有效數(shù)據(jù)的總平均值 M、標(biāo)準(zhǔn)差 SD 以及 ±2SD 范圍

表 14 細(xì)胞百分比有效數(shù)據(jù)的總平均值 M、標(biāo)準(zhǔn)差 SD 以及 ±3SD 范圍

2.3 參考品的最終定值

剔除離群值后，有 5 家單位在 6 個(gè)流式檢測平臺(tái)上（Navious、FC500、DxFLEX、Canto II、Calibur、Bricyte E7）進(jìn)行了檢測，將此 9 個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下的 34 個(gè)有效數(shù)據(jù)（表 1 ~ 9）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，求總平均值 M 和標(biāo)準(zhǔn)差 SD 以及總體變異系數(shù) CV%，如表 13 ~ 14 所示。賦值結(jié)果較為理想，各實(shí)驗(yàn)條件下對(duì) CD3+細(xì)胞百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）、CD3+CD4+細(xì)胞百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）、CD3+CD8+細(xì)胞百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）的賦值結(jié)果總變異系數(shù) CV% 均小于 4.0%；CD3-CD19+細(xì)胞百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）的賦值結(jié)果總變異系數(shù) CV% 小于 8.0%；對(duì) CD45+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量、CD3+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量、CD3+CD4+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量、CD3+CD8+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量、CD3-CD19+細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量的賦值結(jié)果總變異系數(shù) CV% 均小于 15.0%；NK 細(xì)胞（CD3-CD56+，或者 CD3-CD16+CD56+）百分比（占 CD45+細(xì)胞數(shù)）和絕對(duì)數(shù)量的賦值結(jié)果總變異系數(shù) CV% 分別為 12.3% 和 18.4%。

故 T/B/NK 淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量以 34 個(gè)有效數(shù)據(jù)的 M ± 2SD 作為可接受范圍，T/B/NK 淋巴細(xì)胞的百分比以 34 個(gè)有效數(shù)據(jù)的 M ± 3SD 作為可接受范圍，以對(duì)人淋巴細(xì)胞國家參考品進(jìn)行定值。該參考品最終定值結(jié)果如下：① CD45+白細(xì)胞數(shù)：2202 ~ 3662 個(gè)/μl；② CD3+成熟T 淋巴細(xì)胞數(shù)：1720 ~ 2831 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 73.1% ~ 82.6%；③ CD3+CD4+輔助/誘導(dǎo) T 淋巴細(xì)胞數(shù)：894 ~ 1501 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 36.5% ~ 45.4%；④ CD3+CD8+抑制/細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞數(shù)：667 ~ 1062 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 26.6% ~ 32.6%；⑤ CD3-CD19+B 淋巴細(xì)胞數(shù)：180 ~ 313 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 6.7% ~ 10.3%；⑥ CD3-CD16+或者 CD3-CD16+CD56+的 NK 細(xì)胞數(shù)：214 ~ 463 個(gè)/μl，占 CD45+白細(xì)胞的百分比為 7.4% ~ 16.0%。

3 討論

本研究中的實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，均是參照 WS/T 360-2011 《流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》。各亞群細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均采用單平臺(tái)法[1]，即用于流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞絕對(duì)濃度的一種方法，所有結(jié)果均來自流式細(xì)胞儀一臺(tái)儀器的測定。濃度的測定可以直接通過測定體積的方法或間接的通過加入已知濃度的熒光微球來計(jì)算。單平臺(tái)方法消除了兩臺(tái)儀器所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。

本研究中協(xié)作標(biāo)定實(shí)驗(yàn)室基本涵蓋了所有在流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞領(lǐng)域有影響力的國內(nèi)外生產(chǎn)企業(yè)，包括貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司、碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司、北京曠博生物技術(shù)股份有限公司、邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司等；使用的淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑也基本涵蓋了已取得醫(yī)療器械產(chǎn)品注冊(cè)證的不同廠家產(chǎn)品，同時(shí)還包括了 4 色和 6 色試劑；使用的流式細(xì)胞儀檢測平臺(tái)也基本涵蓋了所有已批準(zhǔn)上市的儀器。這些儀器和試劑也是在臨床檢測中廣泛使用的。所以保證了本參考品定值的準(zhǔn)確性，能夠滿足其作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。

在 6 家協(xié)作標(biāo)定公司中，有一家公司采用流式細(xì)胞儀體積計(jì)數(shù)法，使用 4 色和 6 色 T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒，測得參考品的 T/B/NK 淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的數(shù)據(jù)整體低于參考品的賦值范圍下限，但測得的百分比數(shù)據(jù)均在參考品的賦值范圍內(nèi)，究其原因可能與該公司的實(shí)驗(yàn)操作過程細(xì)節(jié)控制有關(guān)。臨床樣本一般為全血，檢測時(shí)需要添加溶血素，溶血素中含有一定的表面活性劑，可以減少細(xì)胞抱團(tuán)和管壁黏附現(xiàn)象；與臨床全血樣本不同，國家參考品復(fù)溶后不需要使用溶血素，且細(xì)胞濃度較低，如果參考品加樣體積偏小并使用缺乏表面活性劑的流式管上樣檢測，可能會(huì)導(dǎo)致測得細(xì)胞數(shù)量偏低。

綜上所述，該批人淋巴細(xì)胞國家參考品可用于人 T/B/NK 淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑和絕對(duì)計(jì)數(shù)試劑（流式細(xì)胞法）的準(zhǔn)確性評(píng)價(jià)。

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*同為第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.014

國家科技重大專項(xiàng)（2018ZX10732401-003-009）

黃杰，Email：jhuang5522@126.com；楊振，Email：yangzhen@ nifdc.org.cn

2020-07-09