王利娟，常 棖

（北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

人工授精是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛、最有效的生豬繁殖技術(shù)。豬人工授精技術(shù)在我國養(yǎng)豬業(yè)已經(jīng)取得了很高的效率，對豬品種改良和選育做出了巨大貢獻(xiàn)。盡管豬冷凍精液技術(shù)取得了重大進(jìn)展，但液體保存仍然是廣大豬場豬精子保存的主要方法。而在激烈的市場競爭中，人們希望通過提高精液保存的質(zhì)量來進(jìn)一步提高育種效率。文章簡要回顧了過去和現(xiàn)在世界范圍內(nèi)豬液態(tài)精液和冷凍精液保存、應(yīng)用的情況，并對非洲豬瘟下改進(jìn)豬精液保存技術(shù)助力生豬生產(chǎn)提出了建議。

1 發(fā)展情況

在全球的動物生產(chǎn)繁殖領(lǐng)域中，人工授精技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，取得了極為可觀的成績。該技術(shù)的應(yīng)用，使得優(yōu)質(zhì)種公畜的配種率和利用率均得到了大幅提高，加速了優(yōu)質(zhì)家畜的改良進(jìn)程，并且還克服了公母畜因?yàn)樯眢w素質(zhì)、偏好、生殖器官異常等造成的配種困難，提高了生產(chǎn)繁育的安全性，減少了疾病的傳播；而且可以減少飼養(yǎng)種公畜所需要的場地、飼料、和勞動力等飼養(yǎng)成本。人工授精技術(shù)最先應(yīng)用到牛的生產(chǎn)繁殖中，而真正應(yīng)用到豬的生產(chǎn)中比牛要晚得多。在20世紀(jì)初期，來自俄羅斯的科研人員就嘗試進(jìn)行對豬的人工輸精，這是有報(bào)道以來世界上第一次將該技術(shù)運(yùn)用到豬身上。豬人工授精技術(shù)在1932年首次試驗(yàn)成功，后來該技術(shù)在許多國家中運(yùn)用；隨著技術(shù)的進(jìn)步，日本和英國等幾個國家率先實(shí)現(xiàn)了將豬人工授精達(dá)到了實(shí)用水平。我國的豬人工授精技術(shù)推廣應(yīng)用在20世紀(jì)50年代開始試行，隨著我國生豬養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，該技術(shù)在20世紀(jì)70年代末開始得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，而后在全國得到了普及推廣，進(jìn)一步提高了我國生豬生產(chǎn)的存欄量與良種質(zhì)量。而在國際方面，自從20世紀(jì)80年代人工授精獲得技術(shù)革新后，人工授精技術(shù)在極短的時間內(nèi)迅速普及到歐美多個發(fā)達(dá)國家中。目前，在歐美等發(fā)達(dá)國家及中國等主要的豬肉生產(chǎn)國中，人工授精技術(shù)在生豬繁殖的普及率在90% 以上。而豬精液保存水平的提高，是提高人工授精技術(shù)的首要環(huán)節(jié)，可以極大地提高公豬精液使用的時間性和地域性。

在20世紀(jì)30年代的前蘇聯(lián)，科學(xué)家率先進(jìn)行了使用豬新鮮精液進(jìn)行人工輸精的試驗(yàn)并成功地產(chǎn)下仔豬，這是液態(tài)精液在豬人工授精成功使用的最早的報(bào)道。因?yàn)橐簯B(tài)儲存法保存的精子呈現(xiàn)活力活性高、授精成功率較高且操作快捷方便等優(yōu)點(diǎn)，因此，液態(tài)保存的精液得到了了人們廣泛的傳播與應(yīng)用，隨后人們對于豬液態(tài)精液的保存技術(shù)研究更加精準(zhǔn)，推動了該技術(shù)飛速發(fā)展。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)表明，目前全世界每年都有將近1 000萬頭母豬利用人工授精來繁育仔豬，而其中絕大多數(shù)使用的是液態(tài)保存的精液，它們的受胎率均在75%~90%之間。隨著現(xiàn)代交通運(yùn)輸業(yè)的不斷發(fā)展，液態(tài)保存精液的高效便利與相對較低的成本等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)凸顯出來，而這些優(yōu)點(diǎn)是冷凍精液無法比擬的。豬液態(tài)精液應(yīng)用于人工授精已經(jīng)成為生豬生產(chǎn)的主要方式，在提高種公豬的利用效率，推動豬人工授精技術(shù)的發(fā)展中具有重大意義。

在20世紀(jì)50年代及以后，冷凍精液的使用在養(yǎng)牛業(yè)中取得了巨大成功，極大地激起了養(yǎng)豬業(yè)應(yīng)用該技術(shù)的需求。因?yàn)樨i精子在耐凍性上與其他家畜相比有著明顯的個體差異，到20世紀(jì)70年代中期冷凍豬精液并沒有直接被用于實(shí)際生產(chǎn)之中，而是在后來不斷地技術(shù)創(chuàng)造革新發(fā)展后才被成功引進(jìn)生產(chǎn)中。由于精液冷凍方法繁瑣，冷凍精液活力、受胎率和產(chǎn)仔數(shù)等性能指標(biāo)不理想，導(dǎo)致冷凍精液在商業(yè)應(yīng)用中進(jìn)展緩慢。近幾十年來，美國及歐洲一些國家的豬精液冷凍技術(shù)迅速發(fā)展，其豬精液冷凍后的質(zhì)量與牛相比已經(jīng)非常接近了。但因豬冷凍精液的技術(shù)目前主要還是參照于牛冷凍精液的技術(shù)流程，且尚未有明確的針對豬精子的特性的冷凍程序及方法，目前的豬冷凍精液仍然存在凍融后活力下降，部分精子冷凍損傷，精子輸送效率降低，在生殖道存活時間短等問題，加上冷凍程序繁瑣，成本昂貴的因素，在豬場凍精的普及率上遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如液態(tài)精液。對此國內(nèi)外研究者開展了大量關(guān)于提高豬冷凍精液質(zhì)量的研究，并取得了積極進(jìn)展，比如通過向冷凍稀釋液中添加某些物質(zhì)用來提高豬精子冷凍-解凍后的質(zhì)量。

2 應(yīng)用

2.1 人工輸精的進(jìn)步

過去10年中，隨著集約化生豬養(yǎng)殖場的不斷發(fā)展，世界上主要的豬肉生產(chǎn)國中，豬人工授精的應(yīng)用比例達(dá)到了90% 以上。在豬人工授精使用的傳統(tǒng)方法是子宮頸輸精法（CAI），即在豬子宮頸第2~3褶皺部位輸入稀釋好的精液，劑量一般是每次至少30億個精子。而最新的豬子宮深部輸精法(PCAI)，則是在將常規(guī)輸精管插入子宮頸皺褶后，再插入比常規(guī)輸精管長0.15～0.2 m的輸精內(nèi)管，由于其長度較長，形狀較細(xì)，材質(zhì)較軟，因此它可以通過子宮頸皺褶進(jìn)入子宮體，達(dá)到更加精準(zhǔn)高效的輸精效果。根據(jù)研究表明PCAI可直接將精液輸送到子宮體，避免了精液滯留在子宮頸皺褶處，可以減少精液的使用量，大大減少了精液的浪費(fèi)，其精液劑量只需要保證每份精液中精子總數(shù)在10億個精子以上，即可達(dá)到與CAI相同的效果。近年來有實(shí)驗(yàn)室報(bào)道已將PCAI精子使用數(shù)降至5億個也可達(dá)到相似效果?？梢姂?yīng)用PCAI技術(shù)，養(yǎng)豬生產(chǎn)者可以使優(yōu)質(zhì)公豬的精液對更多的母豬進(jìn)行人工授精，極大地降低了優(yōu)質(zhì)精子采購成本，提高了精子的利用率。但該技術(shù)目前也存在一些缺點(diǎn)，就是在后備母豬上操作難度大，輸精管價(jià)格昂貴增加成本，而且如果操作不當(dāng)會給母豬帶來損傷，所以PCAI技術(shù)的應(yīng)用仍然具有挑戰(zhàn)性。而在公豬精液價(jià)格相對較低的國家和地區(qū)，PCAI似乎不太有吸引力。

2.2 性別分類控制技術(shù)

動物的性別分類控制技術(shù)是通過人為干預(yù)動物的正常生殖過程，使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術(shù)。性別控制技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中有著重大的意義。通過控制后代的性別比例，可充分發(fā)揮受性別限制和影響的生產(chǎn)性狀(如泌乳、生長速度、肉質(zhì)等)的最大經(jīng)濟(jì)效益。目前性別分類技術(shù)在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的發(fā)展較為成熟，但是其在養(yǎng)豬業(yè)中的應(yīng)用還不夠全面。其實(shí)早在1991年，Johnson就報(bào)告了首例的豬精液性別分類方法，隨后該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，篩選儀器、軟件和精子分揀速度都有了進(jìn)一步的發(fā)展，使其更適用于低劑量豬人工授精，但因?yàn)樨i特殊的解剖結(jié)構(gòu)，仍然需要大量精子用于子宮頸內(nèi)人工授精，增加了養(yǎng)殖成本，從而限制了豬性別分類精子在生豬生產(chǎn)中的應(yīng)用。2006年由中國科學(xué)家主持研究的，世界首例通過分離x、y精子的性別控制技術(shù)進(jìn)行人工授精而獲得的小水牛誕生。這種x、y精子分離技術(shù)被稱為貝爾茨維爾精子性別鑒定技術(shù)，而后性別控制技術(shù)結(jié)合人工授精開始廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中。2009年中國首例性別控制豬在廣西誕生，其中運(yùn)用的性別控制技術(shù)與牛類似，即利用x精子和y精子之間DNA含量的差異，先將精液染色，然后利用x精子與y精子在流式細(xì)胞儀中的熒光強(qiáng)度不同，將兩者分離，最后用于人工授精技術(shù)，向受體母豬中輸入分離得到的x精子或y精子。但是在實(shí)驗(yàn)過程中，豬比牛更為困難，具體其原因有：1）有研究表明，豬的x和y精子之間DNA含量的差異小，只有3.6%，不容易分辨；2）豬精子在進(jìn)行分離處理過程中極易受損，在分離過程中，精子會被稀釋、染色、擠壓、激光照射等處理，稍微有一點(diǎn)處理不當(dāng)實(shí)驗(yàn)就會失??；3）豬的人工授精需求量大，需要長時間進(jìn)行分離。目前，精子按性別分類，其產(chǎn)生效率只有每小時20億～25億個精子，生產(chǎn)效率不高，而且在分離過程中會損失相當(dāng)數(shù)量的精子，從而產(chǎn)生相對較高的生產(chǎn)成本，加之由于豬人工授精技術(shù)的限制，當(dāng)養(yǎng)殖場在現(xiàn)有條件下使用性別分類精子時，生育能力和產(chǎn)仔數(shù)都會受到影響，因此性別控制技術(shù)批量應(yīng)用于生豬生產(chǎn)仍有一段路要走。

一些機(jī)構(gòu)已經(jīng)對性別冷凍精液進(jìn)行了研究，這仍然是一件棘手的問題，因?yàn)閺木拥谋４娣矫鎭砜?，冷凍豬精子解凍后活力不高，而對精子的篩選又會不可避免地造成部分精子的死亡，加之較昂貴的成本成為阻遏該項(xiàng)技術(shù)發(fā)展的重要原因。所以不斷優(yōu)化性別篩選分類后豬精子的保存和使用技術(shù)，也是今后進(jìn)一步的研究的方向。而對常規(guī)使用的豬精液冷凍保存技術(shù)的突破，可能會更好地促進(jìn)保存性別分類精液的研究。

3 展望

在大多數(shù)豬肉生產(chǎn)國，保存的豬精液在人工授精中的應(yīng)用已得到充分證實(shí)。隨著對豬精液的分析、處理、智能管理和網(wǎng)絡(luò)信息等新技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展，大大提高了具有良種優(yōu)勢的豬精液利用效率。而與有效表型特征相關(guān)聯(lián)的DNA堿基選擇工具的出現(xiàn)為進(jìn)一步提高人工授精的效率提供了幫助。然而全世界人工授精（AI）中僅有1% 是用冷凍解凍的豬精子進(jìn)行的，雖然冷凍儲存的方法幫助了豬精子庫的建立，并且可以保存遺傳物質(zhì)幾十年。但有報(bào)告顯示，將精子在液氮中進(jìn)行長期儲存會影響解凍后精子的質(zhì)量。而冷凍保存程序造成的損害，會直接降低冷凍解凍的豬精子的受精能力和人工授精后的繁殖性能。這種低溫?fù)p傷主要是由于豬精子對冷休克和過氧化損傷的高度敏感性，因?yàn)樵谄滟|(zhì)膜成分中含有很高的不飽和磷脂和低膽固醇。因此，冷凍-解凍程序會導(dǎo)致精子膜失穩(wěn)，從而影響鈣均質(zhì)酶、頂體完整性導(dǎo)致膜脂紊亂。但近年來豬冷凍保存技術(shù)有了飛速的進(jìn)步，這些進(jìn)步涉及冷凍保存程序之前的精子選擇、冷凍和解凍延長劑的添加劑、人工授精技術(shù)的相關(guān)性和受精-排卵間隔，相信隨著這些技術(shù)的進(jìn)步能夠進(jìn)一步解決豬精子冷凍帶來的損傷。在實(shí)際生產(chǎn)中，將科學(xué)研究與實(shí)際生產(chǎn)相結(jié)合是非常重要的，通過技術(shù)的進(jìn)步引導(dǎo)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，將為我國恢復(fù)生豬生產(chǎn)提供良好的支撐。

對液體或冷凍狀態(tài)下將性別分類的精子引入人工授精實(shí)踐，也是為了實(shí)現(xiàn)生豬產(chǎn)業(yè)的復(fù)產(chǎn)擴(kuò)繁這一目標(biāo)。對豬來說，將精子進(jìn)行性別分類后的活力與受精能力均低于直接進(jìn)行人工授精的精子。但有實(shí)驗(yàn)表明，在一定條件下使用低至5×107的精子數(shù)目，仍然可以生產(chǎn)出所需性別的仔豬，結(jié)合目前子宮頸深部授精技術(shù)已經(jīng)取得了一些成功，需要進(jìn)一步努力開發(fā)出更加適用于使用低精子數(shù)進(jìn)行 PCAI的導(dǎo)管。在對照實(shí)驗(yàn)中，使用特殊設(shè)計(jì)的導(dǎo)管可提高母豬的受孕率，減少對精子的浪費(fèi)，提高利用率。而在這一研究領(lǐng)域的成功讓性別分類精液在養(yǎng)豬業(yè)中廣泛應(yīng)用成為了可能。在K.Willenburg的報(bào)告中，總結(jié)了目前人們對豬的性別分類精液做出的努力，盡管之前相對較低的性別分類精子數(shù)限制了其在豬人工授精的應(yīng)用，但隨著科技的進(jìn)步這一情況正發(fā)生著積極地改善?？茖W(xué)家們認(rèn)為，通過篩選出來的豬性別精子可以戰(zhàn)略性地應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè)，以滿足對雄性和雌性豬的不同需求。目前正在研究利用其他生物技術(shù)的最新進(jìn)展，來替代目前流式細(xì)胞術(shù)的方法，這包括通過微流控制設(shè)備對精子進(jìn)行分類，以金納米顆粒為載體對單個精子進(jìn)行序列特異性標(biāo)記或基因編輯，以誘導(dǎo)SYR基因的敲除或干擾，并直接影響帶有Y染色體的精子的功能。

目前，非洲豬瘟的全球蔓延對生物安全提出了挑戰(zhàn)，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了極大威脅。盡管疾病預(yù)防和檢測技術(shù)在當(dāng)前的形勢下發(fā)揮了很大作用，但是抵抗關(guān)鍵病原體進(jìn)入的全面保護(hù)機(jī)制，沒有辦法被充分保證。而引起母豬繁殖失敗或嚴(yán)重疾病的病毒，如豬藍(lán)耳?。≒RRS）、豬流行性腹瀉（PED）或 非洲豬瘟（ASF），很可能會通過臨床上未確診的公豬精液傳播?，F(xiàn)在CRISPR/Cas9技術(shù)可用于產(chǎn)生抗PRRS等病毒的公豬。如果實(shí)驗(yàn)用的公豬符合政府的規(guī)定，并且可以滿足消費(fèi)者的需求，那么對它們經(jīng)過基因工程處理，可以極大地提高養(yǎng)殖場的生產(chǎn)力。如果相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員使用紙質(zhì)微流控設(shè)備和高速DNA擴(kuò)增技術(shù)，對公豬精液進(jìn)行多種病原體的快速現(xiàn)場診斷，那么其將成為性價(jià)比高、便于使用和有效預(yù)防豬病的最佳工具。隨著冷凍精液技術(shù)的發(fā)展，可以將檢測沒有病原體的精液進(jìn)行冷凍保存，使用這種方式可以安全而高效地應(yīng)用于生豬生產(chǎn)中。