杜倍倍，劉磊，朱洋洋

RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin負(fù)調(diào)控STING依賴(lài)的果蠅天然免疫反應(yīng)

杜倍倍，劉磊，朱洋洋

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036

果蠅()利用天然免疫反應(yīng)來(lái)抵御外源病原菌的入侵，其分子調(diào)控機(jī)理在進(jìn)化上非常保守，深入探究果蠅天然免疫調(diào)控機(jī)制對(duì)于人類(lèi)天然免疫及相關(guān)疾病研究具有重要意義。為了發(fā)掘參與調(diào)控果蠅STING信號(hào)依賴(lài)的天然免疫反應(yīng)的新因子，本研究采用雙鏈RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，在體外S2細(xì)胞中對(duì)()、()、()、()、()、()、()、()和()共9個(gè)編碼泛素連接酶的基因進(jìn)行雙鏈RNA敲低實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示()與STING天然免疫信號(hào)水平呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步通過(guò)過(guò)量表達(dá)的方法在S2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)能顯著抑制STING天然免疫信號(hào)。同時(shí)，通過(guò)李斯特菌感染實(shí)驗(yàn)表明，敲低顯著提高果蠅感染后抗菌肽的表達(dá)，并抑制病原菌的增殖，從而提高果蠅感染后的存活率。本研究證明RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin是STING依賴(lài)的果蠅天然免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子，由于果蠅基因和人類(lèi)基因存在高度相關(guān)性，因此本研究為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)人類(lèi)STING相關(guān)的天然免疫疾病治療方法提供了理論基礎(chǔ)。

果蠅；RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin；STING信號(hào)通路；天然免疫

免疫系統(tǒng)分為天然免疫(innate immune system)和獲得性免疫(adaptive immune system)兩大類(lèi)。天然免疫與生俱來(lái)，其反應(yīng)通常極其快速，且對(duì)病原的識(shí)別具有普遍性；獲得性免疫由免疫細(xì)胞針對(duì)抗原發(fā)生特異性免疫應(yīng)答與免疫記憶，往往出現(xiàn)于天然免疫之后，但作用時(shí)間長(zhǎng)久[1,2]。果蠅()具有易于飼養(yǎng)、繁殖周期短、基因組序列豐富以及只能進(jìn)行天然免疫等特點(diǎn)，并且由于天然免疫系統(tǒng)中的重要分子在各個(gè)物種中十分保守，因此果蠅是研究天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的理想模式動(dòng)物。果蠅天然免疫反應(yīng)和人類(lèi)天然免疫反應(yīng)具有高度相似性，因此研究果蠅的天然免疫調(diào)控機(jī)制對(duì)人類(lèi)天然免疫疾病治療具有重要意義[3]。

果蠅天然免疫主要包括細(xì)胞免疫和體液免疫。細(xì)胞免疫主要是通過(guò)血淋巴中的漿細(xì)胞吞噬、包囊外來(lái)病原體；體液免疫則是由Toll和Imd信號(hào)通路組成，分別與哺乳動(dòng)物的TLR4 (Toll-like receptor4)和TNF (tumor necrosis factor)通路類(lèi)似[4]。Toll和Imd信號(hào)通路在果蠅體內(nèi)協(xié)同抵御病原菌入侵，是果蠅天然免疫系統(tǒng)的重要組成成分[5]。當(dāng)機(jī)體受到感染時(shí)，果蠅免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern reco-gnition receptor, PRR)識(shí)別病原微生物，從而激活Toll/Dif或Imd/Relish信號(hào)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs) Attacin、Diptericin、Drosocin、Defensin等，清除體內(nèi)病原物[6~8]。

干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes, STING)是天然免疫信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控分子。在哺乳動(dòng)物中，環(huán)鳥(niǎo)苷單磷酸(GMP)-腺苷單磷酸(AMP)合酶(cGAS)可以識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的DNA，并催化合成第二信使——環(huán)鳥(niǎo)嘌呤腺嘌呤(cyclic AMP- GMP, cGAMP)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜蛋白STING，進(jìn)而誘導(dǎo)I型干擾素的表達(dá)[9,10]。果蠅中存在哺乳動(dòng)物STING直系同源物,果蠅STING在缺少cGAS同源物的情況下，可以直接與病原菌的環(huán)二核苷酸(cyclic dinucleotides, CDNs)結(jié)合，啟動(dòng)宿主細(xì)胞的天然免疫反應(yīng)[11,12]。李斯特菌感染果蠅時(shí)，STING通過(guò)激活NF-κB轉(zhuǎn)錄因子Relish，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽Attacin和Diptericin等，降低宿主的致死率和細(xì)菌載量水平[13]。

RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin已被證實(shí)在固有免疫中起到重要作用[14]。在人體內(nèi)，Roquin通過(guò)識(shí)別靶基因3′非翻譯區(qū)的特異性莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，然后募集CCR4-NOT腺苷酸酶復(fù)合物來(lái)介導(dǎo)mRNA降解，并參與自身免疫的預(yù)防，Roquin的缺乏或功能障礙與自身免疫和炎癥有關(guān)[15]。在小鼠()中，Roquin抑制T細(xì)胞誘導(dǎo)型共刺激物(the inducible T-cell co-stimulator, ICOS)和干擾素-γ (interferon-γ, IFN-γ)表達(dá)以防止T卵泡輔助細(xì)胞(T follicular helper, Tfh)積累，以及在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮作用來(lái)抑制腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)，預(yù)防自身抗體介導(dǎo)的疾病[16]。在脊椎動(dòng)物中Roquin蛋白負(fù)調(diào)控T卵泡輔助細(xì)胞分化和自身免疫[17,18]。在果蠅中，同樣存在Roquin蛋白的同源物，由基因編碼[19]，但是其是否參與調(diào)控果蠅天然免疫反應(yīng)目前還未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。

本研究在果蠅S2細(xì)胞中利用體外RNAi和熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)果蠅基因可能負(fù)調(diào)控STING天然免疫反應(yīng)信號(hào)。經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析，的表達(dá)產(chǎn)物為Roquin蛋白。為了進(jìn)一步證實(shí)RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin是否參與調(diào)控STING信號(hào)通路，在果蠅S2細(xì)胞系中進(jìn)行敲低和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Roquin是STING信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子。同時(shí)利用李斯特菌感染敲低轉(zhuǎn)基因果蠅也證實(shí)了在體內(nèi)負(fù)調(diào)控STING依賴(lài)的天然免疫反應(yīng)。綜上所述，本研究結(jié)果表明RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin是果蠅STING天然免疫信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子，為進(jìn)一步研究人類(lèi)STING天然免疫反應(yīng)調(diào)控機(jī)制以及開(kāi)發(fā)相關(guān)疾病治療新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

果蠅S2細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，使用Sf-900TM Ⅱ SFM (賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)細(xì)胞培養(yǎng)基在27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。敲低轉(zhuǎn)基因果蠅(Sting RNAi)購(gòu)自Bloomington果蠅庫(kù)存中心(31565)。果蠅使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度(25±1)℃，濕度(60±5)%，12 h光和暗交替光照。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

引物設(shè)計(jì)借助于Primer Premier 5.0軟件完成，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物具體信息見(jiàn)表1。

1.3 體外轉(zhuǎn)錄制備雙鏈RNA

用Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)提取S2細(xì)胞的總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)合成、以及3對(duì)雙鏈RNA，引物序列見(jiàn)表1。

1.4 S2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期S2細(xì)胞以2~4×107個(gè)細(xì)胞/mL種植于12孔板中，加入雙鏈RNA，于27℃培養(yǎng)箱孵育。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)到50%~60%時(shí)，使用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000 (美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，27℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36 h[20]。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

用各種dsRNA和pgl3-attp-luc轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞，其中熒光素酶編碼序列位于啟動(dòng)子下方，pac5.1-renilla作為內(nèi)部對(duì)照也轉(zhuǎn)染到S2細(xì)胞[20]。收集轉(zhuǎn)染后的S2細(xì)胞，加入50 μL Reporter Assay Lysis Buffer，冰上裂解20 min。4℃、13,000 r/min離心10 min。取上清液20 μL加入到白色不透明的96孔板中，分別依次加入50 μL Luciferase Assay sub-stance或50 μL Renilla Assay substance，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光活性，進(jìn)行熒光素酶活性分析或Renilla活性分析，按照(Luc-Control)/(Rel-Control)的方式作圖分析數(shù)據(jù)。

1.6 熒光定量PCR

使用Trizol試劑(南京諾唯贊生物科技有限公司)提取總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)合成cDNA，按照SYBR?Premix EX TaqⅡ(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，在iCycler iQ5熒光定量PCR儀(北京安諾倫生物科技有限公司)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果采用2–ΔΔCt法計(jì)算、mRNA相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn)為75℃到95℃，每20 s升溫1℃。引物序列見(jiàn)表1。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡

收集轉(zhuǎn)染后的S2細(xì)胞，加入適量1×PBS，4℃、5000 r/min離心2 min，棄上清獲得細(xì)胞沉淀，按照100∶1的比例加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF (上海百賽生物技術(shù)有限公司)混合液提取蛋白。取10 μL蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗選用小鼠來(lái)源的anti-Flag和小鼠來(lái)源的anti- Actin (上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)；HR標(biāo)記的二抗(美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司)。將發(fā)光顯影液(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)按1∶1的比例適量混勻，通過(guò)凝膠成像儀(北京安諾倫生物科技有限公司)顯示特異性條帶。

表1 引物信息

1.8 構(gòu)建rouqin敲低轉(zhuǎn)基因果蠅

敲低轉(zhuǎn)基因果蠅為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，即針對(duì)目的基因的CDS序列設(shè)計(jì)雙鏈RNA，并使之帶上酶切位點(diǎn)I/R I(NEB)，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成(引物見(jiàn)表1)。將UASp-KN質(zhì)粒[21]用I/R I進(jìn)行雙酶切并回收。將酶切后的線(xiàn)性UASp-KN與雙鏈DNA進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、鑒定并提取shmiR質(zhì)粒。將shmiR質(zhì)粒與Δ2-3質(zhì)粒混合，對(duì)果蠅胚胎進(jìn)行顯微注射，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因果蠅[22]。

1.9 病原菌感染和果蠅存活率

將一根細(xì)針浸入濃縮的李斯特菌過(guò)夜培養(yǎng)物中，感染6 d齡的成年果蠅，對(duì)照組果蠅采用無(wú)菌PBS緩沖液進(jìn)行感染。感染后，清除3 h內(nèi)死亡的果蠅，每天更換果蠅培養(yǎng)管，并統(tǒng)計(jì)死亡個(gè)數(shù)。每管果蠅30~35只，總數(shù)不少于100只，并進(jìn)行至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.10 測(cè)量細(xì)菌負(fù)荷

取10只感染后的果蠅在研磨器中加入1×PBS緩沖液充分研磨，10倍、100倍、1000倍梯度稀釋并接種在LB瓊脂板上，30℃培養(yǎng)48 h，然后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究均做3組重復(fù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和qRT-PCR，結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析使用平均值±SD表示。雙尾學(xué)生檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同樣本之間顯著差異；果蠅感染存活實(shí)驗(yàn)，結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析使用平均值±SD表示。使用PASW Statistics 18軟件通過(guò)LogRank test分析樣本之間顯著差異。*表示<0.05，有差異性；**表示<0.01，差異性顯著；***表示<0.001，差異性極顯著，N.S.表示不具有差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)建立

在S2細(xì)胞中分別加入和雙鏈RNA，之后轉(zhuǎn)染pgl3-attp-luc和pac5.1-renilla質(zhì)粒，并用c-di-GMP激活STING信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的活性確定在體外是否成功構(gòu)建了雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。結(jié)果顯示，STING依賴(lài)的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)在體外S2細(xì)胞中構(gòu)建成功(圖1A)。另外，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)的mRNA表達(dá)量，顯示敲低成功(圖1B)。

2.2 CG16807(roquin)是STING信號(hào)潛在負(fù)調(diào)控因子

為篩選可能調(diào)控STING免疫信號(hào)的泛素連接酶，在S2細(xì)胞中分別對(duì)()、()、()、()、()、()、()、()和()共9個(gè)編碼泛素連接酶基因進(jìn)行雙鏈RNA干擾，再轉(zhuǎn)染pgl3-attp-luc和pac5.1-renilla質(zhì)粒并用c-di-GMP激活信號(hào)。通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組沉默基因()后，熒光素酶表達(dá)水平顯著升高。上述結(jié)果表明，敲低能明顯提高c-di- GMP激活的天然免疫反應(yīng)水平，暗示Roquin很可能是STING天然免疫信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子(圖2)。

2.3 Roquin在STING介導(dǎo)的天然免疫中起負(fù)調(diào)控作用

本研究在S2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染針對(duì)的3對(duì)雙鏈RNA，qRT-PCR結(jié)果顯示，這些雙鏈RNA均能有效敲低S2細(xì)胞中的表達(dá)(圖3A)。為了進(jìn)一步證實(shí)RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin是否參與調(diào)控STING依賴(lài)的果蠅天然免疫反應(yīng)，本研究在S2細(xì)胞中利用合成的3個(gè)雙鏈RNA敲低表達(dá)水平，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNAi組熒光素酶活性顯著上調(diào)(圖3B)。進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)S2細(xì)胞中抗菌肽基因的表達(dá)，結(jié)果與預(yù)期一致，與對(duì)照組相比，在S2細(xì)胞敲低，抗菌肽基因、的表達(dá)顯著升高(圖3：C，D)。上述結(jié)果表明，在S2細(xì)胞中Roquin是STING天然免疫信號(hào)的負(fù)調(diào)控因子。

圖1 在S2細(xì)胞構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)及sting敲低檢測(cè)

A：STING信號(hào)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的建立；B：S2細(xì)胞敲低驗(yàn)證。**：<0.01；***：<0.001。

圖2 CG16807(roquin)可能負(fù)調(diào)控STING天然免疫信號(hào)通路

熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)S2細(xì)胞中9種泛素連接酶基因RNAi后對(duì)STING信號(hào)的影響。N.S.表示不具有差異性；**：<0.01。

2.4 過(guò)表達(dá)roquin抑制STING信號(hào)通路

在S2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染不同劑量的pac5.1-flag-roquin質(zhì)粒，并用c-di-GMP激活信號(hào)通路，熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果(圖4A)表明，熒光素酶活性能被顯著抑制且抑制效果與作用濃度呈正相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論，本研究利用qRT-PCR檢測(cè)在激活I(lǐng)md信號(hào)后S2細(xì)胞中抗菌肽基因的表達(dá)量變化。結(jié)果表明在S2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，抗菌肽基因和的mRNA表達(dá)均顯著下降(圖4：B，C)。上述研究結(jié)果表明負(fù)調(diào)控果蠅STING信號(hào)通路。

圖3 Roquin負(fù)調(diào)控STING依賴(lài)的天然免疫反應(yīng)

A：qRT-PCR檢測(cè)雙鏈RNA處理S2細(xì)胞后的mRNA水平；B：熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)S2細(xì)胞中敲低后對(duì)STING信號(hào)影響；C、D：qRT-PCR檢測(cè)S2細(xì)胞中敲低對(duì)抗菌肽基因、表達(dá)的影響。*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。

圖4 過(guò)表達(dá)roquin抑制STING天然免疫信號(hào)

A：熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)S2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)對(duì)STING信號(hào)影響；B、C：qRT-PCR檢測(cè)S2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)對(duì)抗菌肽基因和表達(dá)的影響。N.S.表示不具有差異性；*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。

2.5 Roquin在體內(nèi)負(fù)調(diào)控STING介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)

為了確定Roquin是否在果蠅體內(nèi)負(fù)調(diào)控STING依賴(lài)的天然免疫反應(yīng)，本研究利用UAS-Gal4系統(tǒng)，通過(guò)與Ppl-Gal4雜交，獲得在脂肪體組織特異敲低的轉(zhuǎn)基因果蠅品系。為防止脫靶效應(yīng)，本研究構(gòu)建兩種敲低轉(zhuǎn)基因果蠅(Roquin RNAi-1#, Roquin RNAi-2#)。用李斯特菌感染6 d齡敲低(Sting RNAi)、敲低(Roquin RNAi-1#, Roquin RNAi-2#)以及對(duì)照組(Ppl-Gal4)果蠅，在脂肪體內(nèi)檢測(cè)下游抗菌肽基因和的mRNA表達(dá)水平。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)用李斯特菌感染兩種不同的敲低果蠅后，與對(duì)照組果蠅相比，體內(nèi)抗菌肽的mRNA水平明顯升高(圖5：A，B)。

2.6 敲低roquin抑制果蠅感染李斯特菌后的病原菌增殖并提高存活率

本研究進(jìn)一步檢測(cè)敲低對(duì)果蠅感染李斯特菌后的存活率以及病原菌繁殖情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低果蠅的死亡速度明顯慢于對(duì)照組(Ppl-Gal4)果蠅(圖6A)，說(shuō)明敲低能提高果蠅對(duì)李斯特菌的抵抗能力。在感染李斯特菌后的不同時(shí)間點(diǎn)(感染后0 d、1 d、2 d和3 d)，對(duì)對(duì)照組和敲低果蠅的細(xì)菌滴度定量分析。結(jié)果表明，在果蠅體內(nèi)敲低會(huì)抑制李斯特菌增殖(圖6B)。綜上所述，本研究結(jié)合體內(nèi)外一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin負(fù)調(diào)控果蠅STING依賴(lài)的天然免疫反應(yīng)。

3 討論

由于果蠅的許多基因功能和信號(hào)通路在進(jìn)化上與人類(lèi)非常相近，其天然免疫系統(tǒng)中的重要分子在各個(gè)物種中十分保守，因此研究果蠅的天然免疫調(diào)控機(jī)制對(duì)人類(lèi)先天免疫疾病的治療有重要作用[23,24]。有研究報(bào)道，在果蠅中發(fā)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物相似的cGAS-STING通路，當(dāng)果蠅被微生物感染，STING信號(hào)被激活，能夠使Imd通路中Relish進(jìn)入細(xì)胞核，產(chǎn)生抗菌肽，從而激活免疫應(yīng)答[25]。不過(guò)，果蠅STING依賴(lài)的天然免疫反應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)理尚未有太多研究。

本研究利用RNAi和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，廣泛搜尋可能參與調(diào)控STING信號(hào)的新因子，發(fā)現(xiàn)()可能負(fù)調(diào)控果蠅STING天然免疫信號(hào)。利用生物信息學(xué)方法在Flybase網(wǎng)站查詢(xún)?cè)摶虮磉_(dá)產(chǎn)物為RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin。已有研究表明，在小鼠T細(xì)胞中缺失會(huì)增強(qiáng)Akt-mTOR信號(hào)和蛋白合成，導(dǎo)致小鼠更易患結(jié)腸炎，而抑制PI3K-mTOR信號(hào)通路可糾正缺陷型CD4+T細(xì)胞的分化[26]，過(guò)表達(dá)影響CD4+T細(xì)胞的活化和增殖，并調(diào)節(jié)促炎和抗炎細(xì)胞因子IL-2和TNF-α的分泌[27]。為了探究是否參與調(diào)控果蠅STING信號(hào)通路，本研究在S2細(xì)胞中進(jìn)行敲低和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)敲低能夠提高STING信號(hào)通路的激活水平，過(guò)表達(dá)能有效抑制STING信號(hào)。上述體外實(shí)驗(yàn)證明在S2細(xì)胞中負(fù)調(diào)控STING介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)。本研究進(jìn)一步在果蠅體內(nèi)鑒定Roquin的功能，發(fā)現(xiàn)在果蠅體內(nèi)敲低后，下游抗菌肽基因和的mRNA表達(dá)量上調(diào)，果蠅體內(nèi)病原菌的數(shù)量明顯減少，其生存能力也有明顯提高。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin確實(shí)負(fù)調(diào)控STING依賴(lài)的天然免疫反應(yīng)。

圖5 敲低roquin提高果蠅感染李斯特菌后抗菌肽表達(dá)水平

A、B：qRT-PCR檢測(cè)模擬感染或李斯特菌感染兩種不同的RNAi果蠅后抗菌肽基因和的mRNA水平。 *：<0.05；**：<0.01。

圖6 敲低roquin提高果蠅感染李斯特菌后的存活率并抑制病原菌增殖

A：在果蠅體內(nèi)敲低可以提高果蠅感染李斯特菌后的存活率；B：在果蠅體內(nèi)敲低能抑制李斯特菌增殖。***：<0.001。

綜上所述，本研究揭示了一個(gè)調(diào)控果蠅STING天然免疫信號(hào)的新因子——RNA結(jié)合蛋白R(shí)oquin，為進(jìn)一步探究人類(lèi)STING在致病性感染過(guò)程中的調(diào)控方式以及開(kāi)發(fā)治療人類(lèi)自身免疫性疾病新藥提供了理論基礎(chǔ)[28]。已有研究表明哺乳動(dòng)物Roquin主要靶向免疫相關(guān)因子的mRNA[29]，這為未來(lái)闡明果蠅Roquin負(fù)調(diào)控STING信號(hào)的分子機(jī)制提供方向和思路。

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RNA-binding protein Roquin negatively regulates STING-dependent innate immune response in

Beibei Du, Lei Liu, Yangyang Zhu

utilizes innate immune response to defend against exogenous pathogens. The molecular regulation mechanism of the process is evolutionarily conservedResearch of the regulatory mechanisms ofinnate immunity is greatly significantfor understanding the modulation of the human innate immunity and the pathogenesis of related diseases. To explore novel regulators in the STING-dependent innate immune response in, we utilized the double-stranded RNA-mediated gene expression silencing technique and the dual-luciferase

; RNA-binding protein Roquin; STING signaling pathway; innate immunity

reporter system in knockdown experiments on 9 genes encoding the ubiquitin ligase such as(),(),(),(),(),(),(),() and() in the S2 cells. The results suggested a negative correlation between() and the STING signaling pathway. Further studies showed that over-expression ofin S2 cells significantly inhibited STING innate immune signaling. Meanwhile,infection experiments showed that knocking down ofmarkedly elevated the expression levels of anti-microbial peptides and inhibited the proliferation ofthus increasing the survival rates post pathogenic infection. Taken together, our results suggested that the RNA-binding protein Roquin negatively regulates the STING-dependent innate immune response inIn view of the high correlation betweengenes and human genes, this study provides a theoretical basis for further development of treatments for STING-related innate immune diseases in humans.

2020-06-27;

2020-10-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31871470)和安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)人才引進(jìn)項(xiàng)目(編號(hào)：03080008)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31871470), and Talent Introduction Project of Anhui Agricultural University (No. 03080008)]

杜倍倍，在讀碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：細(xì)胞生物學(xué)。E-mail: 1482565154@qq.com

劉磊，在讀碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：微生物學(xué)。E-mail: 13127281150@163.com

杜倍倍和劉磊并列第一作者

朱洋洋，在讀博士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：昆蟲(chóng)分子生物學(xué)。E-mail: zhuyyahau@163.com

10.16288/j.yczz.20-196

2020/12/8 9:14:06

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20201204.1505.001.html

(責(zé)任編委: 嚴(yán)冬)