朱巖 樊根濤 曹莉莉 周光新

細(xì)胞外囊泡 ( extracellular vesicles，EVs ) 是由細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層納米囊泡，內(nèi)含有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等維持正常細(xì)胞生理功能和介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的因子[1]。EVs 異質(zhì)性較大，不同的細(xì)胞分泌的 EVs 具有迥異的組成特點(diǎn)和功能[2]。EVs 從初始被認(rèn)為細(xì)胞代謝廢物到目前生物學(xué)功能逐漸受到重視，除了在細(xì)胞間信號通訊有重要作用外，還廣泛參與細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)展、血管生成和免疫反應(yīng)等。幾乎所有細(xì)胞在生理和病理情況下都分泌 EVs，并且在血液、尿液、唾液等體液中都可以發(fā)現(xiàn) EVs[3-4]。EVs在腫瘤微環(huán)境中被大量觀察到，不僅參加腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，也與多種骨疾病相關(guān)[5]。

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，它多發(fā)于青少年和兒童，老年后達(dá)到第二發(fā)病高峰。雖然基于新輔助化療聯(lián)合手術(shù)治療可以達(dá)到 60%～70% 的5年生存率，但是在復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者中，原有治療方式并不能取得有效的治療效果。因此，需要基于骨肉瘤發(fā)展轉(zhuǎn)移的機(jī)制，探索新的治療方向[6]。近年來，大量外泌體相關(guān)的研究表明 EVs 在骨肉瘤及其腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，但是由于分離方式局限、囊泡大小不一，部分情況下外泌體和微泡難以嚴(yán)格區(qū)分。因此，筆者以EVs 來綜述其在骨肉瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥和治療等方面的機(jī)制，探討其在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用方面的前景。

一、骨肉瘤細(xì)胞來源的 EVs 對腫瘤微環(huán)境的影響

1. 促進(jìn)腫瘤血管生成：腫瘤血管生成參與骨肉瘤生長、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的過程，可以為瘤體提供成長必需的氧氣和營養(yǎng)，并為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，擴(kuò)散至遠(yuǎn)處的器官提供逃逸途徑[7]。在多發(fā)性骨髓瘤、結(jié)直腸癌、前列腺癌和肺癌等其它腫瘤中，已經(jīng)充分認(rèn)識到了腫瘤來源的 EVs在促血管生成中具有重要作用[8]。Jerez 等[9]在對骨肉瘤細(xì)胞系 EVs 內(nèi)容物進(jìn)行蛋白組學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)存在高表達(dá)與血管生成相關(guān)的蛋白。Perut 等[10]同樣發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞分泌的 EVs 中高表達(dá)的蛋白如 serpin-E1、TIMP-1等和 miRNA如 miR-382-5p、miR-150-5p 以及 miR-125b-5p 等能夠幫助腫瘤血管生成，且這種活性隨腫瘤微環(huán)境酸度的增加而增強(qiáng)。此外，Raimondi 等[11]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤分泌的 EVs 能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和分泌高水平的促血管生成因子VEGF、IL-6和 IL-8[11]。有學(xué)者對 236例骨肉瘤患者血清樣本中 EVs 分析發(fā)現(xiàn)，與健康者相比，骨肉瘤患者血清EVs 中 miR-25-p 的含量明顯增高，進(jìn)一步的實驗表明過表達(dá)的 miR-25-p 能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞功能[12]。隨著骨肉瘤抗血管生長治療的發(fā)展，針對 EVs 促血管形成機(jī)制可能是潛在的治療靶點(diǎn)。

2. 激活破骨細(xì)胞：骨肉瘤是一種成骨腫瘤，但同時破骨細(xì)胞在促骨肉瘤侵襲和化療耐藥中具有重要的作用[13-14]。相應(yīng)的，除分泌破骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子外，骨肉瘤細(xì)胞分泌的 EVs 在改變骨肉瘤微環(huán)境中的骨重塑穩(wěn)態(tài)中也表現(xiàn)出明顯的促破骨細(xì)胞活性[11,13-16]。Rama 等[15]在骨肉瘤細(xì)胞分泌的 EVs 中鑒定出基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP1和 MMP13、轉(zhuǎn)化生長因子 TGF-β 和 RANKL 等促破骨細(xì)胞因子[15,17]。此外，Raimondi 等[11]在 EVs 中發(fā)現(xiàn)了與骨重塑相關(guān)的的 miR-148a-3p 和 miR-21-5p。高表達(dá)的miR-148a-3p 在體內(nèi)骨骼穩(wěn)態(tài)中通過激活 RANKL 信號通路促破骨細(xì)胞生成[17]。miR-21-5p 在破骨細(xì)胞前體中高度表達(dá)，能夠下調(diào) PDCD4( 程序性細(xì)胞死亡 4) 蛋白的表達(dá)水平，消除其對轉(zhuǎn)錄因子 c-Fos 的抑制作用。同時，RANKL 誘導(dǎo) c-Fos 上調(diào) miR-21-5p 的表達(dá)。因此，c-Fos /miR-21-5p / PDCD4形成正反饋環(huán)，促進(jìn) RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成[18-19]。這些研究表明，骨肉瘤細(xì)胞分泌的EVs 在骨肉瘤骨微環(huán)境中能通過激活破骨細(xì)胞來進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

3. 誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞促腫瘤：目前還未知骨肉瘤發(fā)生相關(guān)的特定驅(qū)動基因和起源細(xì)胞，但是目前研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中的表觀遺傳可能是骨肉瘤進(jìn)展過程中的早期事件[20]。處于腫瘤炎性微環(huán)境中的間充質(zhì)干細(xì)胞通過分泌一系列細(xì)胞因子、炎性因子及趨化因子促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[21]。作為細(xì)胞間通訊的重要載體，與上述激活破骨細(xì)胞的生物學(xué)特性相似，骨肉瘤細(xì)胞通過 EVs 誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成為促腫瘤進(jìn)展的幫兇。Mannerstr?m 等[22]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞來源的 EVs 內(nèi) LNE 1( 長散布核元件 1) 低甲基化后調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的表觀遺傳，進(jìn)而促進(jìn) MMP1、VEGF-A和 ICAM 1( 細(xì)胞間黏附分子 1) 的表達(dá)。骨肉瘤細(xì)胞衍生的 EVs 可以通過激活間充質(zhì)干細(xì)胞的促腫瘤和促轉(zhuǎn)移表型而一步促進(jìn)自身的轉(zhuǎn)移過程[23]。Baglio 等[24]發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤小鼠模型中，骨肉瘤來源的 EVs 選擇性地升高膜相關(guān)形式的 TGF-β，并激發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌 IL-6促使骨肉瘤小鼠荷瘤生長和轉(zhuǎn)移形成[25-26]。上述研究均發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的發(fā)展，但是部分研究表明處理和改造后的間充質(zhì)干細(xì)胞可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長[25-27]。提示阻斷 EVs 在骨肉瘤細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞中的通訊作用后，間充質(zhì)干細(xì)胞可能成為骨肉瘤治療新的方向。目前，骨肉瘤來源的 EVs 促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞促腫瘤的研究較少，其機(jī)制值得進(jìn)一步探討。

4. 促進(jìn)免疫抑制和化療耐藥：近年來隨著骨肉瘤腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞互相作用的研究的深入，免疫治療也成為骨肉瘤輔助治療的潛在選擇[28]。Clayton等[29]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞分泌 EVs 運(yùn)載 TGF-β，抑制 IL-2誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，其抑制效率是可溶性 TGF-巴的上千倍。除此以外，他們還發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞 EVs 內(nèi) TGF-除顯著下調(diào) CD8+T 細(xì)胞外、還可抑制 NK 細(xì)胞表面 NK 細(xì)胞受體 NKG2D 的表達(dá)，從而降低機(jī)體淋巴細(xì)胞的活化及對腫瘤細(xì)胞的免疫[30]。

在犬骨肉瘤模型中，Troyer 等[31]在來源于骨肉瘤的EVs 中發(fā)現(xiàn)對 T 細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)作用的 TGF-β，AFP( 甲胎蛋白 ) 和 HSPs ( 熱休克蛋白 )，這些蛋白可以抑制CD4+和 CD8+T 細(xì)胞的活化和增殖能力。PD-L1( 程序性死亡配體 1) 通路的激活可以幫助骨肉瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，目前研究證明了 PD-L1的過表達(dá)與骨肉瘤中轉(zhuǎn)移風(fēng)險的增加有關(guān)[32-33]。在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移后的黑色素瘤細(xì)胞釋放攜帶 PD-L1的 EVs，可用于預(yù)測抑制 PD-1/ PD-L1治療的效果[34]，在骨肉瘤中能否通過腫瘤細(xì)胞分泌的 EVs 中 PD-L1判斷預(yù)后及免疫治療效果值得進(jìn)一步研究。

腫瘤細(xì)胞在化療治療后會對該藥產(chǎn)生獲得性耐藥性，稱為原藥耐藥 ( primary drug resistance，PDR )，同時其還會對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的其它抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，即多藥耐藥 ( multidrug resistance，MDR )。雖然新輔助化療的應(yīng)用使得骨肉瘤患者的 5年生存率由不足 20% 升至65%～70%，但是仍有約 30% 的患者化療后進(jìn)展惡化?；谛螺o助化療方案是骨肉瘤治療中的重要部分，已有研究表明多藥耐藥導(dǎo)致晚期骨肉瘤預(yù)后不佳，成為臨床上骨肉瘤治療的主要障礙[35]。目前，眾多臨床前和臨床數(shù)據(jù)表明黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和腎癌等實體腫瘤化療后會分泌 EVs 至非耐藥細(xì)胞，誘導(dǎo)多藥耐藥表型[36]，由此可見，EVs 在腫瘤多藥耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。EVs 在骨肉瘤耐藥中同樣起關(guān)鍵作用[33]。Torreggiani 等[37]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生多藥耐藥的骨肉瘤細(xì)胞可以分泌包裹耐藥相關(guān)性 mRNA及其產(chǎn)物 P-糖蛋白的 EVs，誘導(dǎo)非耐藥細(xì)胞系產(chǎn)生多藥耐藥表型，降低骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感性[38]。由此可見，EVs 作為生物活性載體，其包裹的耐藥相關(guān)的因子和非編碼 RNA 有希望成預(yù)測治療效果和預(yù)后的標(biāo)志物，以及逆轉(zhuǎn)耐藥和克服進(jìn)展期骨肉瘤的治療靶點(diǎn)[38-39]。

二、腫瘤微環(huán)境內(nèi)細(xì)胞來源 EVs 的功能

間充質(zhì)干細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞可以通過旁分泌和囊泡分泌促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和化療耐藥[40]。Wang 等[41]發(fā)現(xiàn)包裹在癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌的 EVs 中的 miR-1228通過下調(diào) SCA1( 干細(xì)胞抗原 1) 的表達(dá)來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。另一項研究結(jié)果表明間充質(zhì)干細(xì)胞來源的EVs 通過激活 Hedgehog 信號通路介導(dǎo)對骨肉瘤的促腫瘤作用[42]。Lin 等[43]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞來源的 EVs 通過激活 PI3K / AKT 和 HIF-1a 信號通路支持缺氧條件下 U2OS骨肉瘤細(xì)胞系的生長[44]。除此以外，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞與骨肉瘤細(xì)胞共存，并參與骨肉瘤細(xì)胞的生長和存活。它們分泌 EVs 的能力已經(jīng)在其它病理生理模型中得到證實[33,44-46]。進(jìn)一步研究這些細(xì)胞分泌的 EVs 如何作用于骨肉瘤細(xì)胞，將有助于闡明腫瘤微環(huán)境中參與細(xì)胞通訊的新因素和新機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)和生物標(biāo)記物。

三、EVs 作為骨肉瘤相關(guān)生物標(biāo)志物

鑒于液體活檢的無創(chuàng)性、可重復(fù)取材、持續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點(diǎn)，液體檢測成為惡性腫瘤的診斷和預(yù)后檢測新的方向。EVs 廣泛存在于血液、尿液和唾液等體液中，并具有穩(wěn)定的膜結(jié)構(gòu)，含有具有功能性的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和非編碼 RNA 等，從而具有成為生物標(biāo)志物的巨大潛力[47]。利用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量檢測手段，明確體液中腫瘤相關(guān) EVs 和正常人之間的差異表達(dá)和特異性因子，對于疾病的診斷及預(yù)后的評估具有良好的臨床價值和意義[48]。Brady 等[49]對犬血清樣本中 EVs 的蛋白組學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn) EVs 內(nèi)蛋白有助于區(qū)分骨肉瘤犬、健康犬和創(chuàng)傷性骨折犬的模型。除此以外，其還在患者血清 EVs 中發(fā)現(xiàn)了蛋白 SerpinD1和 MHC III 類補(bǔ)體 C6可以預(yù)測患者分期。Xu等[50]通過對化療反應(yīng)不同的患者血清 EVs 內(nèi) miRNA 對比發(fā)現(xiàn)，患者血清 EVs 內(nèi) miRNA 可能成為骨肉瘤患者化療敏感性相關(guān)標(biāo)志物。Bao 等[51]發(fā)現(xiàn)與骨肉瘤未轉(zhuǎn)移的患者血清中 EVs 相比，發(fā)生骨肉瘤轉(zhuǎn)移的患者血清中 EVs 中RNA 測序表明腫瘤突變負(fù)荷增加，可能成為預(yù)測骨肉瘤進(jìn)展?jié)撛诘臉?biāo)志。目前，瑞金醫(yī)院的一項評估骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中循環(huán)外泌體 RNA 作用的臨床試驗 ( NCT03108677)正在進(jìn)行中。

總之，骨肉瘤微環(huán)境中骨肉瘤細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等共存并相互聯(lián)系，EVs 在其細(xì)胞間通訊具有重要作用。一方面，骨肉瘤細(xì)胞分泌 EVs 到達(dá)受體細(xì)胞后促進(jìn)腫瘤支持特性。另一方面，來源于腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的 EVs 能夠幫助腫瘤的生長和遷移。具有源頭細(xì)胞的細(xì)胞膜特定組分和特異性包裹物的 EVs 具有成為診斷及預(yù)后標(biāo)志物的巨大潛力。EVs 在骨肉瘤中具有上述多種功能，為發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和新的診斷分析提供了新的思路。日后，EVs 純化和表征方面的技術(shù)進(jìn)步有望更好的幫助 EVs 的檢測和其生物特性研究，其在骨肉瘤臨床應(yīng)用前景更加廣闊。