王曉梅，張忠山，周俊波，潘偉成，孫斯麒，徐年軍

（1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000；2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211）

龍須菜（Gracilarialemaneiformis）屬杉藻目（Gigartinales），江蘺科（Gracilariaceae），江蘺屬。藻體中含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)成分。主產(chǎn)地分布在中國山東、遼寧、江蘇、福建等?。?］。近年來，學(xué)者對龍須菜進(jìn)行營養(yǎng)成分分析表明，其營養(yǎng)價值非常高［2］。研究發(fā)現(xiàn)，龍須菜內(nèi)多糖含量占藻體干重的比例超過30%，龍須菜多糖的多種優(yōu)異活性也逐漸引起學(xué)者的重視［3］。因此，本文對龍須菜多糖的提取純化方法及生理活性研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為龍須菜多糖的應(yīng)用開發(fā)提供參考，并為龍須菜的高值化綜合利用提供借鑒。

1 龍須菜多糖的提取

龍須菜藻體較其他藻類堅(jiān)硬，進(jìn)行多糖提取時困難較大。因此，尋找一種能有效提高多糖得率及其生物活性的提取方法非常重要。目前，龍須菜多糖的提取方法主要有溶劑浸提法、物理輔助提取法、酶解浸提法等。

1.1 溶劑浸提法

龍須菜多糖是極性大分子，含大量的羥基，易溶于水。采用稀酸、稀堿與熱水進(jìn)行抽提是常見提取方法，其中，熱水提取法是近年來提取龍須菜多糖常用的方法。有研究表明，江蘺屬紅藻粗多糖的膠體類型和非膠體類型在結(jié)構(gòu)、溶解度以及生理活性等方面差別很大［4］。史晨杉等［5］發(fā)現(xiàn)從龍須菜中提取的粗多糖通過冷凍后溶解可以形成膠體多糖和非膠體多糖。實(shí)際上，兩者僅在硫酸基團(tuán)和3，6-內(nèi)醚半乳糖的含量方面存在差異。朱地琴等［6］將50℃水提的龍須菜粗多糖進(jìn)行凍融，獲得膠體和非膠體兩種多糖，發(fā)現(xiàn)膠體多糖的溶出率和多糖含量均顯著高于非膠體多糖，但是后者的免疫活性極顯著高于前者。然而，大多數(shù)研究者未對膠體多糖和非膠體多糖加以區(qū)分，僅按照混合多糖進(jìn)行處理，提取工藝上稍有差異。如楊永利等［7］水提獲取龍須菜多糖時優(yōu)選方案為提取溫度100℃、提取時間4 h、料液比1∶100、醇沉濃度60%，多糖得率34.6%。由于水提最佳工藝有所差異，使得龍須菜多糖的得率范圍較大，為9%～30%不等［8-11］。

酸提法中以檸檬酸提取法為主。游麗君等［12］比較了檸檬酸、熱水、超聲、超聲協(xié)同等4種提取方法得到的多糖的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)檸檬酸法下多糖的得率最高，達(dá)到（17.81±0.34）%。獲得的多糖分子量和粘度較低，且分子量的均一性較高，因此認(rèn)為檸檬酸提取法是一種提取龍須菜多糖的更有效的方法［12-14］。

堿處理是龍須菜瓊膠生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵工序，處理后再用熱水提取得到的龍須菜多糖主要是瓊膠多糖。史晨杉等［5］發(fā)現(xiàn)堿處理后水提得到的龍須菜非瓊膠多糖的抗氧化活性降低。這是由于堿處理后多糖中硫酸基含量大大降低，說明瓊膠糖分子中的硫酸基含量與抗氧化活性密切相關(guān)。薛志欣等［15］采用相同工藝得到含微量硫酸基的龍須菜瓊膠多糖。FAN等［16］用3 mol·L-1濃度的NaOH溶液在室溫條件下提取龍須菜瓊膠多糖的得率是2.06%，經(jīng)HPGPC檢測得到兩個峰，其中主峰分子量為1.37×106 Da。

1.2 物理輔助提取法

最近幾年發(fā)展起來的超聲波技術(shù)越來越多的被應(yīng)用到植物多糖的提取中。郭守軍等［17］對超聲波輔助提取龍須菜多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)影響多糖提取的主要因素依次為超聲波提取溫度＞功率＞提取時間。在正交實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件下驗(yàn)證提取多糖得率最高可達(dá)24.23%。楊華［18］比較了超聲波和熱水浸提2種工藝，結(jié)果表明，超聲波提取優(yōu)于熱水提取，其提取率最高達(dá)到29.75%，大于熱水提取率的19.60%，可見超聲波提取的明顯優(yōu)勢。

微波是一種超高頻電磁波，非常容易穿透和破碎藻類細(xì)胞，可以大大提高多糖的提取率。楊華和楊震峰［19］通過開展微波浸提影響因素的正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)為：微波功率600 W、提取時間6 min、水與龍須菜質(zhì)量比100∶1，提取率達(dá)到27.60%。顏曉琳和劉楊［20］對龍須菜多糖雙波輔助提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)在超聲波50 W、提取時間31.7 min、微波溫度87℃、料液比1∶60.7條件下龍須菜多糖提取率為34.84%。證明將超聲波與微波結(jié)合提取多糖效果會更佳。

凍融法是近年來興起的一種利用凍結(jié)解凍過程中的冰晶作用破壁的方法，它與超聲波處理都屬于物理破壁技術(shù)。LIU等［21］通過凍融超聲輔助提取優(yōu)化最佳工藝為凍融次數(shù)2次、料液比1∶25、超聲功率320 W、超聲時間10 min，多糖得率為30.54%，該方法是一種效率高、成本低的提取方法。

1.3 酶解提取法

利用酶的催化性高、專一性強(qiáng)及僅需溫和的反應(yīng)條件等特點(diǎn)，將其應(yīng)用到龍須菜多糖的提取過程中，可以促進(jìn)藻體細(xì)胞壁的分解，加速細(xì)胞間質(zhì)多糖的溶出。竺巧玲等［22］用1.5%纖維素酶提取龍須菜多糖，通過優(yōu)化提取工藝獲得的龍須菜多糖的提取率高達(dá)34.79%。WU等［23］采用α-淀粉酶輔助優(yōu)化龍須菜多糖提取工藝，發(fā)現(xiàn)在pH=5、溫度95℃提取40 min的條件下多糖得率可達(dá)49.15%，是目前已有文獻(xiàn)報(bào)道中得率最高的方法。

另外，由于龍須菜多糖中的硫酸基團(tuán)是阻礙瓊膠分子形成凝膠的關(guān)鍵因素，因此尋找脫除硫酸基的方法是制備高質(zhì)量瓊脂的發(fā)展方向。殷勤等［24］利用重組芳香基硫酸酯酶水解海藻龍須菜中的硫酸基團(tuán)，在最佳工藝條件下脫除了78.4%的硫酸基團(tuán)，凝膠強(qiáng)度提高2.1倍，表現(xiàn)出較高的活力。

綜上研究發(fā)現(xiàn)，目前應(yīng)用最廣泛的是溶劑浸提法，該方法中的水提法不使用酸堿，對設(shè)備損耗小、成本低，最適合工廠化生產(chǎn)；酸提和堿提法會得到結(jié)構(gòu)新穎的多糖片段，但對設(shè)備腐蝕嚴(yán)重。物理輔助提取法提取效率高、分離純化流程方便，但成本較高。酶解浸提法過程溫和，提取效率高，適合工廠化生產(chǎn)，但專一性酶缺乏，無法普遍使用。

2 龍須菜多糖的純化與結(jié)構(gòu)解析

龍須菜同江蘺屬中其他多糖類似，都屬于瓊膠類型，即由（1-3）-β-D-半乳糖與（1-4）-3，6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖交替連接的瓊二糖重復(fù)單元組成。如果提取與純化方法不同，所得龍須菜多糖硫酸基和甲氧基的數(shù)量和位置均不同［25］。CHIRAPART等［26］發(fā)現(xiàn)日本龍須菜多糖主要由瓊二糖、瓊膠糖前體組成，6-O-甲基-瓊二糖含量較高，還有少量的2-O-甲基-L-半乳糖。

由于龍須菜多糖屬于帶電荷的雜多糖，因此常用葡聚糖凝膠或離子交換樹脂進(jìn)行分級純化。盧佳芳等［27］采用DEAE-Sephadex A-25離子交換層析純化得到龍須菜多糖的3個組分G1、G2和G3，分子量分布在2萬至6萬U之間。主要組成單糖為半乳糖、3，6-內(nèi)醚半乳糖及少量葡萄糖，糖鏈通過1→2鍵與1→6鍵方式連接，或者通過1→3鍵與1→2鍵方式連接。薛志欣等［15］將龍須菜瓊膠多糖依次經(jīng)DE-22和Sephadex G-200柱層析純化，得到一種含微量硫酸基的瓊膠多糖，此多糖經(jīng)Q-Sepharose柱層析鑒定為單一組分，但未對結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步詳細(xì)研究。

宮春宇等［28］采用 DEAE-Sepharose F.F.柱層析和Sephacryl凝膠層析方法，系統(tǒng)純化龍須菜粗多糖，最終得到分子量為9.3×104Da的均一多糖GCpF1-1B。該多糖中半乳糖、果糖和葡萄糖醛酸組成比例為 14.28∶3.85∶1。WEN等［14］采用DEAE-Sepharose F.F.柱層析分離純化檸檬酸提取龍須菜粗多糖，得到 GLP-1到GLP-5等5個組分。其中，GLP-1較為特殊，基本上由葡萄糖組成（90.76%）；GLP-2和GLP-3則含較多的半乳糖、葡萄糖以及少量鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖；而GLP-4和 GLP-5相似，均不含阿拉伯糖和甘露糖。

由于目前對龍須菜多糖精細(xì)結(jié)構(gòu)的報(bào)道還比較少，比如支鏈的鏈接方式、單糖的鏈接位置等都不清楚，需進(jìn)一步深入研究。

3 龍須菜多糖的生物活性

3.1 抗腫瘤活性

龍須菜多糖抗腫瘤機(jī)制是目前生物活性中研究較多的，表現(xiàn)在直接和間接抑瘤活性。分子量對龍須菜多糖抗腫瘤活性影響較大。張昆［29］將由熱水提取法提取的TP和FGP兩種多糖用氧化還原法降解獲得8個不同分子量的多糖，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)降解的 TP（分子量為83 400）的抑瘤作用最強(qiáng)，隨著多糖分子量的降低，抑制作用先逐漸減小然后增大，至分子量為17 571時（TP5）抑瘤作用又達(dá)到最強(qiáng)，之后多糖若繼續(xù)被降解，其對Hela癌細(xì)胞的抑制作用又呈現(xiàn)降低的趨勢。

龍須菜多糖可以通過直接抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤活性。KANG等［30-31］將三氯乙酸法提取的龍須菜多糖作用于肺癌A549細(xì)胞后，隨著作用濃度及時間的增加，癌細(xì)胞增殖能力及存活率逐漸降低，抑制率逐漸增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則改變，接觸生長狀態(tài)減少，數(shù)量減少，細(xì)胞核受到損傷，細(xì)胞發(fā)生凋亡，72 h后上述改變更為明顯。

龍須菜多糖還可以通過免疫調(diào)節(jié)作用達(dá)到體內(nèi)抗腫瘤效果。FAN等［32］發(fā)現(xiàn)龍須菜酸性多糖增強(qiáng)了荷瘤小鼠免疫器官的免疫功能，同時能夠有效調(diào)節(jié)小鼠白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的激增，顯著增強(qiáng)荷瘤小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖能力，提高脾NK細(xì)胞的殺傷活性。

抗氧化作用也是龍須菜多糖抗腫瘤活性的機(jī)制之一。陳美珍等［33］發(fā)現(xiàn)龍須菜多糖能顯著降低荷瘤小鼠肝勻漿中脂質(zhì)過氧化LPO含量，在灌胃劑量為150 mg·kg-1時抑瘤率可達(dá)到63.56%。

復(fù)合多糖往往具有抑瘤增效作用。謝好貴等［34］發(fā)現(xiàn)由龍須菜多糖、壇紫菜多糖和毛頭鬼傘多糖以質(zhì)量配比為6∶6∶3復(fù)配組成的復(fù)合多糖，當(dāng)劑量為1 000μg·mL-1時，對人宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制率達(dá)76.30%，分別高于同劑量的3種單一多糖。該復(fù)合多糖能提高凋亡蛋白酶基因caspase-10、caspase-3表達(dá)水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

龍須菜多糖抗腫瘤活性機(jī)制并不是獨(dú)立的，是多個靶點(diǎn)綜合的結(jié)果，其具體分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

3.2 免疫調(diào)節(jié)活性

藻類多糖的免疫調(diào)節(jié)活性是藻類藥理研究的熱點(diǎn)。龍須菜多糖的免疫調(diào)節(jié)活性主要表現(xiàn)在免疫增強(qiáng)或免疫刺激，顯示出多方面的調(diào)節(jié)活性，包括對巨噬細(xì)胞、炎癥因子、NK細(xì)胞等的影響。

龍須菜多糖對巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用比較顯著。宮春宇等［28］發(fā)現(xiàn)龍須菜多糖在體外可以有效激活小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMMs），且呈現(xiàn)良好劑量依賴關(guān)系。當(dāng)在高濃度500μg·mL-1條件下，激活率為420%。陳美珍等［35］發(fā)現(xiàn)龍須菜天然多糖能顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性（P＜0.05），當(dāng)增加或脫去硫酸根時，免疫活性均下降，尤其脫去硫酸基后下降更明顯。

龍須菜多糖對炎癥因子的影響效果明顯。任穎朗等［13］發(fā)現(xiàn)由檸檬酸提取的龍須菜多糖能降低光老化小鼠血清白介素-10的含量，提高小鼠血清腫瘤壞死因子-α的含量，說明該多糖能緩解光老化小鼠的免疫抑制作用。REN等［36］發(fā)現(xiàn)酸提取純化的龍須菜多糖GLP-2能通過激活巨噬細(xì)胞 RAW264.7的iNOS、IL-6和TNF-α的表達(dá)而顯示出優(yōu)異的抗炎活性。

龍須菜多糖對其他免疫細(xì)胞也有調(diào)節(jié)作用。范艷麗等［37］分析當(dāng)效靶比為20∶1時，龍須菜酸性多糖GLSPs高劑量組小鼠的NK細(xì)胞殺傷能力較空白組小鼠顯著增高（P＜0.05），殺傷率近90%，同時使小鼠白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞略有增加，表明GLSPs對非特異性免疫應(yīng)答具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

龍須菜多糖具有抗過敏活性。時超嵐等［38］通過腹腔注射龍須菜寡糖能顯著降低過敏小鼠血清特異性IgE和IgG1水平，提高特異性IgG2a水平（P＜0.05）。通過灌胃能顯著降低小鼠糞便中組胺水平（P＜0.05），且能有效緩解空腸組織過敏病理現(xiàn)象。小鼠脾淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該寡糖能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯水平上顯著降低Th2細(xì)胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）含量（P＜0.05），促進(jìn)Th1細(xì)胞因子IFN-γ分泌。說明龍須菜寡糖能有效調(diào)節(jié)輔助性T細(xì)胞的免疫功能向Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)換，從而抑制Th2細(xì)胞主導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)。

多糖普遍具有免疫增強(qiáng)活性，研究多糖的免疫活性將為開發(fā)免疫增強(qiáng)劑或保健品提供理論基礎(chǔ)。由此可見，龍須菜多糖具有較強(qiáng)的應(yīng)用前景。

3.3 抗氧化活性

多糖結(jié)構(gòu)具有還原性的半縮醛羥基，可以還原自由基，最終達(dá)到清除自由基的目的。近年來的研究表明，龍須菜多糖具有優(yōu)異的抗氧化活性。

分子量對龍須菜多糖的抗氧化活性有一定影響。楊文鴿等［39］研究發(fā)現(xiàn)在清除超氧陰離子自由基、DPPH自由基和還原Fe3+方面，龍須菜多糖的抗氧化活性隨分子量的降低而增強(qiáng)，而在清除羥基自由基方面，抗氧化活性卻隨多糖分子量的降低而減弱。

堿處理對龍須菜多糖抗氧化活性影響較大。史晨杉等［5］研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過堿處理后，龍須菜多糖對清除羥自由基和超氧陰離子、抑制卵黃脂質(zhì)過氧化和小鼠紅細(xì)胞氧化溶血的影響低于未經(jīng)過堿處理的多糖。這是由于堿處理后多糖中硫酸基含量大大降低，而硫酸基是抗氧化活性降低的主要原因。

提取工藝不同，得到的龍須菜多糖結(jié)構(gòu)也不同，抗氧化能力也會不一樣。竺巧玲等［40］發(fā)現(xiàn)利用復(fù)合酶法提取的龍須菜多糖具有較強(qiáng)的清除羥自由基能力，微波提取的多糖具有較強(qiáng)的Fe3+還原能力，而超聲波法提取得到的多糖具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子能力，認(rèn)為這可能與其含有的硫酸基團(tuán)以及分子量分布有關(guān)。

龍須菜多糖具有對機(jī)體細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)能力。SHI等［41］發(fā)現(xiàn)分級純化的龍須菜多糖GCP-2對H2O2誘導(dǎo)的脾細(xì)胞損傷保護(hù)作用可達(dá)到92.8%。DI等［42］研究顯示龍須菜多糖分級組分GRPS-3-2和GRPS-2-1能極顯著增加H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞PC-12的增殖率（P＜0.01），最高可達(dá)75%以上。GUO等［43］將龍須菜多糖與草酸誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）共同孵育后，其細(xì)胞活性和SOD活性明顯升高、LDH和MDA含量顯著降低（P＜0.05），表明龍須菜多糖能通過抑制草酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性減少細(xì)胞損傷。

雖然龍須菜多糖明確的抗氧化機(jī)制仍待深入研究，但其優(yōu)異的抗氧化活性為其開發(fā)成為抗氧化劑提供了參考。同時，抗氧化活性也是眾多其他生物活性的重要作用基礎(chǔ)，為解釋相關(guān)生物活性原理提供了理論依據(jù)。

3.4 其他活性

目前報(bào)道的海藻多糖普遍具有降血糖活性。WEN等［14］研究了龍須菜多糖對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠的影響，發(fā)現(xiàn)其可顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平、提高胰島素分泌水平、減輕胰島β細(xì)胞的損傷、增加β細(xì)胞數(shù)量，表現(xiàn)出優(yōu)異的降糖活性。

在抗病毒方面，龍須菜多糖也表現(xiàn)出顯著活性。CHEN等［44］發(fā)現(xiàn)龍須菜多糖的硫酸基含量在13%時，抗人流感病毒H1-364的能力最強(qiáng)。一旦超過或小于此含量時其抑制病毒作用均下降。

利用多糖的特殊結(jié)構(gòu)和性質(zhì)合成納米材料已成為納米材料制備領(lǐng)域的新興課題。HE等［45］以龍須菜多糖為模板，設(shè)計(jì)合成了多糖-二氧化鈦復(fù)合薄膜?；钚詫?shí)驗(yàn)表明，該復(fù)合薄膜能有效抑制大腸埃希菌（Escherichiacoli）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的生長，并且在包裝圣女果后起到營養(yǎng)保持與品質(zhì)改善效果。JIANG等［46］在構(gòu)建納米硒（SeNPs）靶向體系基礎(chǔ)上，用龍須菜多糖進(jìn)行修飾，該復(fù)合納米體系能夠顯著提高對整合素αvβ3靶向能力，從而提高其抗腦膠質(zhì)瘤U87和C6活性，降低其毒副作用。以上表明，龍須菜多糖是一種優(yōu)良的藥物載體材料。

龍須菜多糖也具有抗突變活性。陳美珍等［47］發(fā)現(xiàn)，龍須菜多糖能有效抑制環(huán)磷酰胺誘發(fā)的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核和精子畸變。在4 g·kg-1劑量時，微核抑制率達(dá)到最大，超過89.8%。

龍須菜多糖在食品加工領(lǐng)域也有應(yīng)用。杜佳佳等［48］發(fā)現(xiàn)添加了脫除酸性多糖的龍須菜纖維粉能使豬肉腸的蒸煮損失率和離心失水率分別下降95.27%和71.62%，且隨著龍須菜粉添加的增加保水效果逐漸增強(qiáng)。表明龍須菜粉可以作為一種天然保水劑來替代磷酸鹽改善豬肉腸的品質(zhì)。

4 小結(jié)與展望

近年來關(guān)于龍須菜多糖的研究報(bào)道越來越多，從提取、結(jié)構(gòu)解析到生物活性等方面都取得了顯著進(jìn)展。但是也存在一些問題，比如：龍須菜非瓊膠多糖的工藝改進(jìn)不夠穩(wěn)定；對龍須菜多糖的藥理活性機(jī)理的研究不夠深入；新活性的擴(kuò)展研究不夠多；在食品和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用還未實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，等等。未來，國內(nèi)外學(xué)者可在上述方面加強(qiáng)研究，對瓊膠多糖與非瓊膠多糖加強(qiáng)區(qū)分、大力開拓龍須菜多糖的應(yīng)用范圍、綜合開發(fā)龍須菜的保健與食品價值，以提升龍須菜的附加值。