郭玉娟，馮映業(yè)，王永南，嚴(yán)珊珊*

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，根據(jù)最新調(diào)查顯示2018年全球新增210 萬(wàn)乳腺癌患者，占女性所有癌癥病例的25%。中國(guó)乳腺癌每年發(fā)病率為21.6/10 萬(wàn)女性，死亡率5.7/10 萬(wàn)女性［1］。乳腺癌嚴(yán)重危害人們的身體健康、影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)也給社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，涉及癌細(xì)胞和宿主細(xì)胞兩方面之間的相互作用，是一個(gè)多階段、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。研究表明，DNA 甲基化表觀遺傳學(xué)改變所導(dǎo)致的基因表達(dá)異常也是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因。然而，DNA 甲基化的最新檢測(cè)技術(shù)有哪些，其在乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療中的作用如何，以及其在乳腺癌臨床應(yīng)用中優(yōu)勢(shì)和不足之處何在，這正是本文將研究和探討的問(wèn)題。

1 甲基化的定義及檢測(cè)技術(shù)

DNA 甲基化（DNA methylation）指在DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）為甲基供體，DNA 序列的5"端胞嘧啶5 位碳原子結(jié)合上一組甲基的過(guò)程，可以穩(wěn)定遺傳給子代DNA序列［2］。DNA 甲基化多發(fā)生在富含鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的序列即CpG 島上，大多數(shù)CpG 島是位于啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)子區(qū)域的CpG 島甲基化與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的抑癌基因的失活有關(guān)。因此，CpG 島甲基化模式的定位已成為了解正?；蚝筒±砘虮磉_(dá)的重要工具，可參與多種抑癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默，是腫瘤發(fā)生早期常見的表觀遺傳事件［3］。依據(jù)對(duì)樣本DNA 的預(yù)處理方法，可以將DNA 甲基化檢測(cè)的手段分為三大類［4］：①基于限制性酶切預(yù)處理：通過(guò)限制性內(nèi)切酶HpaII 處理來(lái)檢測(cè)DNA甲基化，保護(hù)甲基化CpG 位點(diǎn)，而未甲基化CpG 被酶消化，但是酶處理只能識(shí)別CpG 位點(diǎn)（CCGG）之前的胞嘧啶，因此不能完全準(zhǔn)確地顯示基因組中甲基化情況的全貌；②基于亞硫酸氫鹽處理：DNA可以將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，與未甲基化的DNA 相比，甲基化的DNA 有不同的堿基組成，可使用測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量分析，是目前DNA 甲基化檢測(cè)與分析的主流方法，常見的檢測(cè)方法有甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）、MethyLight、digital MSP、核酸質(zhì)譜、甲基化芯片、測(cè)序等；③基于親和富集預(yù)處理：使用甲基結(jié)合蛋白從基因組DNA 中分離出CpG 島，再使用HpaII 酶切來(lái)確認(rèn)分離區(qū)域的甲基化狀態(tài)，序列通過(guò)Southern blotting 或基于微陣列分析，適用于高通量分析，但耗時(shí)、昂貴的儀器和數(shù)據(jù)分析難。

2 基因甲基化與乳腺癌的診斷、監(jiān)測(cè)和隨訪

流行病學(xué)研究顯示，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療有效于提高乳腺癌的生存率。乳腺癌影像學(xué)診斷包括乳腺超聲（ultrasonography，US）、乳腺X線攝影（mammography，DM）、乳腺斷層攝影（digital breast tomosynthesis，DBT）、MRI、正電子發(fā)射斷層顯像（positron emission tomography-computed tomography，PET-CT）等，是常見的乳腺癌篩查和診斷方式，但因影像學(xué)診斷主觀性較強(qiáng)、部分檢查有射線輻射、以及年輕女性乳腺腺體較致密等，可能導(dǎo)致部分病人過(guò)度診斷、過(guò)度治療。因此，需要探討更準(zhǔn)確、高效的分子標(biāo)志物來(lái)提高早期乳腺癌診斷率。DNA 甲基化是乳腺癌中常見的分子事件，且DNA 甲基化修飾過(guò)程比蛋白質(zhì)翻譯早。與檢測(cè)癌癥相關(guān)蛋白表達(dá)水平相比，DNA 甲基化可能成為乳腺癌早期診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

活組織檢查是有創(chuàng)性的，不適用于常規(guī)的乳腺癌篩查和手術(shù)后的常規(guī)隨訪，尤其是在無(wú)可見腫瘤病灶的情況下。血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞仍可能顯示DNA 甲基化特征，因此體液活檢等無(wú)創(chuàng)方法對(duì)于乳腺癌的早期篩查、診斷和治療后續(xù)活動(dòng)極為重要。Li M 等［5］人在一項(xiàng)薈萃分析評(píng)估RASSF1A 甲基化對(duì)乳腺癌診斷的價(jià)值。本研究共納入19 篇文獻(xiàn)，涉及1849 例患者和1542 例對(duì)照。用于診斷乳腺癌的RASSF1A 甲基化的敏感性，特異性，診斷比值比（DOR）和AUC 曲線下面積分別為0.49、0.95、19.0 和0.83。甲基化特異性PCR（MSP）的靈敏度（0.64vs0.57），DOR（21.0vs14.0）和AUC（0.89vs0.86）優(yōu)于其他方法（q-MSP，OS-MSP 和MethyLight）。MSP 檢測(cè)血清RASSF1A 甲基化適合診斷乳腺癌。Tang Q 等［6］人薈萃分析基于血液的DNA 中的整體DNA 甲基化概況和基因特異的DNA 甲基化，研究納入乳腺癌（BC）患者血液來(lái)源的DNA 與健康對(duì)照相比的甲基化水平，通過(guò)全基因組甲基化分析，并用甲基化特異性PCR 驗(yàn)證特定基因特異性甲基化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BC 患者表觀基因組全血DNA 低甲基化，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的BRCA1、RASSF1A 甲基化的頻率更高，但是證據(jù)仍然十分有限。Radpour R 等［7］對(duì)十個(gè)候選基因（APC、BIN1、BMP6、BRCA1、CST6、ESR-b、GSTP1、

P16、P21、TIMP3）進(jìn)行研究，研究分為兩個(gè)隊(duì)列：第一個(gè)隊(duì)列包含來(lái)自乳腺癌患者的36 個(gè)血漿樣本和健康對(duì)照的30 個(gè)血漿樣本，第二個(gè)隊(duì)列包含60 個(gè)三重匹配樣本（癌組織，匹配的正常組織和血清樣本）來(lái)自20 例非家族性乳腺癌患者。研究發(fā)現(xiàn)在同一患者的血清和腫瘤組織中，有七個(gè)基因顯示出一致的甲基化，這支持了以下假設(shè)：血清DNA 來(lái)源于并準(zhǔn)確反映了原發(fā)性腫瘤的DNA甲基化譜。使用八個(gè)基因（APC、BIN1、BRCA1、CST6、GSTP1、P16、P21、TIMP3）作為開發(fā)基于血液的乳腺癌檢測(cè)方法，可以區(qū)分腫瘤和正常樣品的敏感性和特異性超過(guò)90%。Huang KT 等［8］通過(guò)DNA 甲基化分析鑒別原發(fā)性乳腺癌和復(fù)發(fā)性乳腺癌，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道納入甲基化的基因（RASSF1A、

TWIST1、APC、WIF1、MGMT、MAL、CDH13、RARβ、BRCA1、CDH1、CDKN2A、TP73、GSTP1），使用這些基因的甲基化圖譜在29 個(gè)腫瘤（16 個(gè)同側(cè)和13個(gè)對(duì)側(cè)），將69%的同側(cè)腫瘤和15%的對(duì)側(cè)腫瘤歸為復(fù)發(fā)。Dedeurwaerder 等［9］人最近進(jìn)行了詳細(xì)的全基因組DNA 甲基化分析，分析了248 個(gè)乳腺癌腫瘤樣本，包括123 個(gè)樣本的“模型組”（4 個(gè)正常和119 個(gè)浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌（IDC））和125 個(gè)樣本的“驗(yàn)證組”（8 個(gè)正常和117 個(gè)IDC），DNA 甲基化譜圖將乳腺癌分為六個(gè)類型，其中三個(gè)類定義了未按表達(dá)亞型分類的新基團(tuán)，這些可能反映了不同的起源細(xì)胞。但是，主要樣本量太小，無(wú)法調(diào)查這些甲基化類別的預(yù)后價(jià)值?？梢姡贒NA 甲基化可能作為應(yīng)用于乳腺癌早期診斷和分型的分子標(biāo)志物，但目前的研究納入樣本量較少并缺乏前瞻性研究。

3 基因甲基化在乳腺癌治療中的應(yīng)用

化療、內(nèi)分泌治療及生物靶向治療是乳腺癌治療的重要手段，但由于藥物耐藥、毒副作用等限制最佳治療方案的制定，因此，積極尋找特定的分子標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)患者對(duì)特定藥物的敏感性從而實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療顯得尤為重要。研究表明DNA 甲基化有望作為預(yù)測(cè)藥物治療療效潛在的分子標(biāo)志物。

3.1 DNA 甲基化與化療

2018年發(fā)表在Breast Care（Basel）的文章提示PITX2 低甲基化的早期淋巴結(jié)陽(yáng)性乳腺癌患者確實(shí)受益于基于蒽環(huán)類藥物的輔助化療，PITX2 高甲基化的患者DNA 甲基化率（約30%）顯示不良的預(yù)后，因此應(yīng)考慮使用其他化療方案。Absmaier M 等［10］人在一項(xiàng)回顧性研究中，通過(guò)甲基化特異性qRT-PCR（qMSP）測(cè)定新鮮冷凍的腫瘤組織標(biāo)本（n=56）中的PITX2 DNA 甲基化狀態(tài)。對(duì)于以輔助全身性蒽環(huán)類為基礎(chǔ)的化療方案治療的非轉(zhuǎn)移性TNBC 患者，PITX2 DNA 低甲基化狀態(tài)（＜6.35）的非轉(zhuǎn)移性TNBC 患者預(yù)后較差。新輔助化療后未達(dá)病理完全反應(yīng)（pCR）的三陰性乳腺癌（TNBC）患者預(yù)后不良，帶有BRCA-1 種系突變的TNBC 對(duì)紫杉烷的反應(yīng)可能較弱，F(xiàn)oedermayr M 等［11］研究CMF 在BRCA-1 甲基化或TP53 突變的紫杉類新輔助化療后術(shù)后病理未達(dá)pCR 患者中術(shù)后輔助化療的療效。通過(guò)定量甲基化特異性PCR 測(cè)定石蠟標(biāo)本中BRCA-1 甲基化狀態(tài)，Sanger 測(cè)序檢測(cè)TP53 突變狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRCA-1 甲基化的比例為41.7%，而TP53 突變的比例為66.7%。在27.5 個(gè)月的中位隨訪中，BRCA-1 甲基化患者的DFS 較差（20%vs64.3%，P=0.0472），而TP53 突變狀態(tài)與預(yù)后無(wú)關(guān)。同源重組（HR）DNA 修復(fù)的失調(diào)與乳腺癌的致癌性和化學(xué)敏感性有關(guān)。Watanabe Y 等［12］了16個(gè)HR基因的甲基化狀態(tài)，使用亞硫酸氫鹽-焦磷酸測(cè)序分析以下HR 相關(guān)基因的異常DNA 甲基化狀態(tài)：BRCA1、BRCA2、BARD1、MDC1、RNF8、RNF168、UBC13、ABRA1、PALB2、RAD50、RAD51、RAD51C、MRE11、NBS1、CtIP、ATM，并分析了它們與腫瘤亞型的關(guān)系以及對(duì)新輔助化療的反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNBC 中BRCA1 和RNF8 甲基化的發(fā)生率顯著高于Luminal 型乳腺癌，BRCA1 甲基化的患者pCR 率 較高，RNF8 甲基化的患者pCR 率較低。2017年Oncol Lett。發(fā)表的文章顯示局部晚期乳腺癌患者的RASSF1A 和WIF-1 基因甲基化在預(yù)測(cè)TAC 方案新輔助化療的臨床療效具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3.2 DNA 甲基化與內(nèi)分泌治療

2007年發(fā)表在Eur J Cancer 的文章顯示PITX2的甲基化可以預(yù)測(cè)他莫昔芬治療的激素受體陽(yáng)性乳腺癌的預(yù)后，低甲基化的患者中有86%的患者10年后無(wú)轉(zhuǎn)移，而高甲基化程度患者僅為69%［13］。Harbeck N 等［14］通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)對(duì)比福爾馬林固定石蠟包埋的（FFPE）和新鮮冰凍的荷爾蒙受體陽(yáng)性、淋巴結(jié)陰性的乳腺癌組織中PITX2 甲基化，研究石蠟標(biāo)本中的PITX2 DNA甲基化能否作為預(yù)測(cè)三苯氧胺內(nèi)分泌治療后患者的預(yù)后，研究發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)新鮮冷凍和FFPE 組織的PITX2 DNA 甲基化具有一致性。

3.3 DNA 甲 基 化 與 抗HER-2 治 療

對(duì)曲妥珠單抗獲得性耐藥是治療HER2 陽(yáng)性乳腺癌患者的主要臨床問(wèn)題。耐曲妥珠單抗的患者的選擇是精確腫瘤學(xué)的巨大挑戰(zhàn)。Yamaguchi T等［15］從前瞻性乳腺癌新輔助臨床試驗(yàn)中招募的患者中取活檢組織樣品，檢測(cè)HER2 陽(yáng)性乳腺癌中癌癥相關(guān)表觀遺傳學(xué)改變。收集24 例HER2 陽(yáng)性乳腺癌組織樣品，通過(guò)下一代測(cè)序儀分析了409個(gè)與癌癥相關(guān)的基因的遺傳變異和通過(guò)帶有485512 探針的磁珠陣列分析DNA 甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在9 例乳腺癌中WNT 途徑可能被其負(fù)調(diào)控因子（如DKK3 和SFRP1）的異常甲基化激活；在10 例乳腺癌中p53 通路因其下游基因異常甲基化而失活。Palomeras S 等［16］通過(guò)全基因組DNA 甲基化（450K 陣列）和轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-Seq），比較了曲妥珠單抗敏感（SK）和曲妥珠單抗耐藥（SKTR）HER2+人乳腺癌細(xì)胞模型。分別通過(guò)亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序和qRT-PCR 驗(yàn)證候選基因的甲基化和表達(dá)水平。通過(guò)基因沉默和過(guò)表達(dá)在SK 和SKTR模型中進(jìn)行功能測(cè)定。通過(guò)亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序法對(duì)24 種HER2+人BC 樣品中對(duì)曲妥珠單抗的治療有完全反應(yīng)或無(wú)反應(yīng)的甲基化分析。表觀基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示TGFBI 在SKTR 模型中的異位表達(dá)表明對(duì)曲妥珠單抗治療的敏感性增加。在原發(fā)性腫瘤中，HER2+乳腺癌患者的TGFBI 高甲基化與曲妥珠單抗耐藥性顯著相關(guān)。仍需進(jìn)一步臨床研究驗(yàn)證TGFBI 啟動(dòng)子的高甲基化作為HER2 +乳腺癌患者中曲妥珠單抗耐藥性的生物標(biāo)志物。Ishihara H 等［17］使用TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的微陣列數(shù)據(jù)篩選了非癌性乳腺組織中未甲基化的基因和乳腺癌組織中甲基化的基因，并分離了12 個(gè)基因，建立基于DNA 甲基化的乳腺癌細(xì)胞分?jǐn)?shù)標(biāo)記。該標(biāo)記可預(yù)測(cè)HER2 陽(yáng)性乳腺癌對(duì)曲妥珠單抗的治療反應(yīng)。

4 甲基化與乳腺癌的預(yù)后

目前腫瘤患者的預(yù)后評(píng)估多建立在臨床病理分期和組織學(xué)特征上。然而，相同分期的患者生存時(shí)間會(huì)存在異質(zhì)性，因此尋找新模型更準(zhǔn)確判斷患者預(yù)后有重要意義。利用特異性DNA 甲基化發(fā)揮分子分型等作用來(lái)進(jìn)行腫瘤預(yù)后評(píng)估具有巨大潛力。

Gy?rffy B 等［18］研究DNA 甲基化的基因表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后相關(guān)性，以及在乳腺癌亞型與DNA甲基化之間的聯(lián)系。通過(guò)對(duì)乳腺癌患者的兩個(gè)隊(duì)列（n=1938 和n=1640）的薈萃分析，評(píng)估了乳腺癌亞型中144 個(gè)異常甲基化基因的表達(dá)的預(yù)后價(jià)值。在104 例乳腺癌的模型組中，還研究了不同基因區(qū)域中基因表達(dá)與DNA 甲基化之間的相關(guān)性。分別計(jì)算每個(gè)基因的生存率和Pearson 相關(guān)性分析。48 個(gè)基因的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.05），這些預(yù)后基因中的32 個(gè)的表達(dá)與甲基化相關(guān)。特定的甲基化模式已經(jīng)與乳腺癌亞型相關(guān)聯(lián)，與ER-/基底樣腫瘤相比，ER+乳腺癌的特征是甲基化的頻率明顯更高，表明DNA 甲基化譜可能在不同的乳腺癌亞型的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，這些異常甲基化的生物標(biāo)志物在乳腺癌亞型中的預(yù)后價(jià)值以及DNA 甲基化在不同基因區(qū)域中的復(fù)雜作用仍是有爭(zhēng)議的話題，需要在較大的獨(dú)立隊(duì)列中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。此外DNA 低甲基化和高甲基化可能影響乳腺癌的進(jìn)展和預(yù)后，分別導(dǎo)致癌基因的過(guò)表達(dá)和腫瘤抑制基因的下調(diào)［19］。盡管DNA 甲基化通常與基因表達(dá)負(fù)相關(guān)，但仍出現(xiàn)了更為復(fù)雜的情況。miRNA 是表觀遺傳機(jī)制的一部分，并且還可以通過(guò)DNA 甲基化進(jìn)行表觀遺傳修飾，因此其甲基化狀態(tài)的任何改變都可能影響其表達(dá)。Oltra SS 等［20］在35 歲＜的乳腺癌中研究miRNA 編碼基因的甲基化差異，以便確定這些患者中潛在的生物標(biāo)志物，分析了的miRNA 編碼基因的9961 CpG位點(diǎn)調(diào)節(jié)子的甲基化。鑒定了193個(gè)差異甲基化的CpG 位點(diǎn)（P＜0.05，甲基化差異為±0.1），基于Infinium Human Methylation 450k 陣列的驗(yàn)證了10 個(gè)CpG 位點(diǎn)。使用癌癥基因組圖譜（TCGA）、Clariom D 和Affymetrix 數(shù)據(jù)集進(jìn)行了薈萃分析，觀察到miR-124-低甲基化可為老年患者帶來(lái)明顯更高的生存率，并將其確定為BCVY 中潛在的特異性生存生物標(biāo)志物。Widschwendter M 等［21］研究發(fā)現(xiàn)化療前樣本中CTC 和EFC＃93 血清DNA 甲基化陽(yáng)性的患者中，超過(guò)70%的患者在五年內(nèi)復(fù)發(fā)；在3～6 個(gè)月和6～12 個(gè)月內(nèi)診斷出患有致命性乳腺癌的患者中有42.9%和25%血清EFC＃93 DNA 甲基化。

5 目前存在的問(wèn)題和展望

乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中DNA 甲基化差異涉及多個(gè)基因，高通量測(cè)序檢測(cè)乳腺癌全基因組DNA 甲基化圖譜可以對(duì)乳腺癌進(jìn)行準(zhǔn)確分類，此類甲基化圖譜可用于精準(zhǔn)指導(dǎo)乳腺癌的治療策略，但是檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高以及精度仍欠佳。部分回顧性研究已經(jīng)鑒定出的少量DNA 甲基化可作為乳腺癌治療和預(yù)后的預(yù)測(cè)因子［22］。但關(guān)鍵的問(wèn)題是這些DNA 甲基化標(biāo)記物仍缺乏前瞻性研究，另一個(gè)問(wèn)題是仍需確定DNA 甲基化標(biāo)記是否比當(dāng)前的組織病理學(xué)和免疫化學(xué)方法更具優(yōu)勢(shì)。

但是到目前為止的利用DNA 甲基化篩查和診斷早期乳腺癌的數(shù)據(jù)非常有限，開發(fā)用于乳腺癌診斷、監(jiān)測(cè)預(yù)后的無(wú)創(chuàng)性的分子標(biāo)記尤為重要。初步研究表明，血漿樣品中循環(huán)的腫瘤DNA 帶有特定于腫瘤的DNA 甲基化標(biāo)記，可為乳腺癌提供潛在的分子標(biāo)記。到目前為止，尚不清楚基于血液的DNA 甲基化標(biāo)記物是否具有預(yù)后或早期預(yù)測(cè)價(jià)值。此外，尚不清楚原位癌轉(zhuǎn)化浸潤(rùn)性癌時(shí)的DNA 甲基化標(biāo)記，如果存在這種DNA 甲基化標(biāo)記，可以提供乳腺癌的早期診斷的分子標(biāo)記物，尤其是在血清DNA 中可以檢測(cè)出來(lái)的標(biāo)志物。

DNA 甲基化標(biāo)記物相對(duì)于轉(zhuǎn)錄譜具以下優(yōu)勢(shì)：DNA 甲基化可從石蠟標(biāo)本中檢測(cè)，DNA 相對(duì)比較穩(wěn)定，組織材料容易保存，而RNA 很容易被降解，穩(wěn)定性較差，相關(guān)組織標(biāo)本不容易保存。但要篩選可用于診斷早期乳腺癌、乳腺癌分型、預(yù)測(cè)治療及預(yù)后的DNA 甲基化標(biāo)記物仍需進(jìn)一步研究，同時(shí)也需要高通量分析、高精確度、易于檢測(cè)和低成本的甲基化檢測(cè)技術(shù)。 總之，DNA 甲基化在乳腺癌的早期診斷、基于DNA 甲基化的圖譜分型、監(jiān)測(cè)乳腺癌的治療療效和預(yù)后等方面的展現(xiàn)有潛力的應(yīng)用前景，進(jìn)一步有利于乳腺癌的精確診療。