馬石霞，馬咸瑩，丁功濤，王家敏

(1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

小球藻(Chlorella)屬綠藻門，綠藻目，卵胞藻科，小球藻屬[1].小球藻細胞呈橢圓形，體積微小、結(jié)構(gòu)簡單，生長和繁殖速度快，直徑在3～8 μm[2]之間.細胞內(nèi)通常含有1個呈板狀或杯狀的葉綠體.

蛋白質(zhì)在藻細胞的結(jié)構(gòu)和代謝中起著重要作用，是細胞膜結(jié)構(gòu)和參與光合作用催化酶的主要成分.與傳統(tǒng)來源的蛋白質(zhì)相比較，小球藻中通常含有40%～60%的蛋白質(zhì)[3].小球藻含有哺乳動物不能合成的必需氨基酸及優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，如乳球蛋白、卵清蛋白等.其氨基酸組成高于世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)頒布的用于人類營養(yǎng)的蛋白質(zhì)標準[4].作為高蛋白食品來源，小球藻能夠迅速補充體能，因此被FAO列為21世紀人類的健康食品[5].小球藻蛋白具有降血壓和抗氧化的作用.蔡震壽等[6]利用小球藻蛋白質(zhì)水解物對大鼠進行實驗，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓大鼠灌食60 mg PN-1粉末/350 g體重(相當于171.4 mg粉末/kg體重)6 h后，其收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)分別降低2.67 kPa和2.79 kPa重量(BW).王文強[7]和王爽等[8]發(fā)現(xiàn)，酶解小球藻蛋白獲得的水解肽對DPPH自由基的清除率分別為88.53%和68.93%，對羥自由基的清除率分別為96.81%和82.00%，具有顯著的抗氧化作用.

盡管小球藻蛋白具有很多的功效，但葉綠素的存在降低了小球藻蛋白的利用率.小球藻中總色素含量約占4%～5%，其中葉綠素占總色素的60%～80%[9].葉綠素是一種色價較高的鎂卟啉化合物(大于500)，不溶于水，易溶于乙醇、丙酮、氯仿等有機溶劑，微量即可呈現(xiàn)明顯的綠色.為了降低葉綠素對小球藻蛋白的感官影響，得到純度和品質(zhì)較高的小球藻蛋白，需將小球藻葉綠素進行有效脫除.目前常見脫除色素的方法主要有有機溶劑浸提法、超聲波輔助提取法和吸附樹脂法.Kong等[10]利用超聲輔助提取法脫除小球藻葉綠素，發(fā)現(xiàn)在最佳條件下葉綠素的脫除率可達88.9%.李燦良等[11]利用有機溶劑浸提法脫除小球藻葉綠素，脫除率可達53.69 mg/g(藻干物質(zhì)).杜瑩瑩[12]利用改性后的高嶺土脫除藻類葉綠素a，最大去除率可達95%.

本實驗以小球藻粉為原料，通過單因素和正交試驗優(yōu)化小球藻葉綠素脫除工藝，并在此基礎(chǔ)上提取純度較高的小球藻蛋白.

1 材料與方法

本實驗從料液比、脫色液比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間4個因素對小球藻葉綠素脫除率的影響進行實驗.在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的正交試驗法確定小球藻葉綠素的最佳脫除工藝.在此基礎(chǔ)上，利用熱堿法進一步提取小球藻蛋白.

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

小球藻(購自上海光語生物科技有限公司)，無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)，氫氧化鈉、氫氧化鉀(天津市大茂化學試劑廠)，溴甲酚綠、硼酸(天津市凱信化學工業(yè)有限公司)，甲基紅(天津市科密歐化學試劑有限公司)，無水碳酸鈉(天津市恒興化學試劑有限公司)，濃鹽酸(開封中信中貿(mào)化工有限公司)，濃硫酸(上海三鷹化學試劑有限公司)，石英砂(天津市科密歐化學試劑有限公司)，碳酸鈣(天津市百世化工有限公司).

1.1.2 儀器和設(shè)備

HH-S4A型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)，DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，GL21M型高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，AR224CN型電子天平(奧豪斯儀器(常州)有限公司)，L9型可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)，F(xiàn)OSS scrubber 2501福斯蛋白質(zhì)消化儀(福斯中國有限公司)，LGJ-20F型真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司).

1.2 小球藻粉葉綠素含量的測定

1.2.1 葉綠素的脫除

分別稱取小球藻粉0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g于研缽中，加入少量二氧化硅(石英砂)和碳酸鈣粉末及2～3 mL 95%乙醇，冰浴中研磨成小球藻泥，再加入10 mL95%乙醇，暗處靜置10 min.將提取液過濾并用95%乙醇反復(fù)沖洗研缽、研棒和殘渣至無色.最后用95%乙醇定容至50 mL棕色容量瓶中，搖勻后保存在暗處備用.

1.2.2 葉綠素的測定

將上述葉綠素去除液注入光徑1 cm的比色皿中，以95%乙醇作為空白對照，利用可見-分光光度計分別在波長665 nm和649 nm下測定吸光度.當測得的吸光度值大于0.8或小于0.2時，葉綠素提取液應(yīng)做適當?shù)谋稊?shù)稀釋或濃縮，再對其進行測定.

根據(jù)下列計算公式，分別計算出葉綠素a、b的濃度及其總?cè)~綠素濃度(mg·L-1)[13].

95%乙醇去除液中葉綠素濃度的計算公式：

Ca(葉綠素a) =13.95A665-6.88A649

(1)

Cb(葉綠素b) =24.96A649-7.32A665

(2)

CT(葉綠素) =Ca+Cb=18.08A649+6.63A665

(3)

式中：Ca、Cb和CT分別為葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的濃度，單位為毫克每升(mg·L-1)；A665和A649為葉綠素提取液在波長665 nm和649 nm下的吸光度.

按下式計算小球藻粉中葉綠素的含量(mg·g-1).

(4)

(5)

1.3 小球藻粉蛋白含量的測定

本實驗中小球藻蛋白含量利用凱氏定氮法[13]測定.

小球藻蛋白的提取[11]：稱取3 g小球藻粉溶于120 mL質(zhì)量分數(shù)為3%的KOH溶液中， 80 ℃處理2 h后，5 000 r/min離心2 min，棄去上清液，40 mL去離子水洗滌3次后，進行冷凍干燥.

蛋白提取率計算公式：

(6)

1.4 單因素試驗

1.4.1 料液比對小球藻粉葉綠素脫除率的影響

稱取小球藻粉0.4 g、0.6 g、0.8 g、1.0 g、1.2 g溶于40 mL的脫色液(無水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰4)，70 ℃處理2 h后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用等量的去離子水洗滌藻泥，重復(fù)4次，進行冷凍干燥.利用1.3的方法測定小球藻粉葉綠素的含量并計算其脫除率.

1.4.2 脫色液比例對小球藻粉葉綠素脫除率的影響

分別量取不同比例的脫色液(無水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰3、1︰4、1︰5、1︰6、1︰7)40 mL溶解0.6 g的小球藻粉，70 ℃處理2 h后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用等量的去離子水洗滌藻泥，重復(fù)4次，進行冷凍干燥.利用1.3的方法測定小球藻粉葉綠素的含量并計算其脫除率.

1.4.3 反應(yīng)時間對小球藻粉葉綠素脫除率的影響

取0.6 g小球藻粉溶于40 mL的脫色液(無水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰4)，70 ℃下處理不同時間(0.5 h、1.0 h、1.5 h、2 h、2.5 h)后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用等量的去離子水洗滌藻泥，重復(fù)4次，進行冷凍干燥.利用1.3的方法測定小球藻粉葉綠素的含量并計算其脫除率.

1.4.4 反應(yīng)溫度對小球藻粉葉綠素脫除率的影響

取0.6 g小球藻粉溶于40 mL的脫色液(無水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰4 )，在不同溫度(45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)下處理2 h后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用等量的去離子水洗滌藻泥，重復(fù)4次，進行冷凍干燥.利用1.3的方法測定小球藻粉葉綠素的含量并計算其脫除率.

1.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇料液比、脫色液比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間作為試驗因素，以小球藻葉綠素脫除率為指標設(shè)計正交試驗，采用L9(34)的正交試驗表，試驗因素水平見表1.

記錄實驗結(jié)果，利用SPSS和Origin2016軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析.

表1 正交試驗因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 料液比對小球藻粉葉綠素脫除率的影響

如圖1所示，隨著料液比的增加，葉綠素的脫除率逐漸增大.料液比為1.5︰100時葉綠素脫除率為92.73%，此后降低.葉綠素與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密，加入過多的小球藻粉降低了溶液的含水量，葉綠素分子中的親水基團很難從葉綠體中游離出來[14].

圖1 料液比對葉綠素提取率的影響 圖2 脫色液比例對葉綠素提取率的影響

2.1.2 脫色液比例對小球藻粉葉綠素脫除率的影響

如圖2所示，當脫色液比例從1︰3增大到1︰4時，葉綠素的脫除率明顯提高，由86.24%提高至92.48%，此時小球藻中大部分葉綠素已經(jīng)溶出；當脫色液比例超過1︰4后，葉綠素的脫除率開始緩慢降低，原因可能是葉綠素是脂溶性葉綠素，葉綠素的脫除效率受脫色液極性的影響[7].

2.1.3 反應(yīng)時間對小球藻粉葉綠素脫除率的影響

如圖3所示，隨著反應(yīng)時間的延長，葉綠素脫除率呈先上升后下降的趨勢.當反應(yīng)時間達到1.5 h時，葉綠素的脫除率為94.73%.葉綠素通過自由擴散的作用由高濃度的細胞內(nèi)側(cè)通過質(zhì)膜擴散到低濃度的細胞外側(cè).當時間為1.5 h時，細胞膜兩側(cè)的濃度相差不大，此時葉綠素的溶解度已經(jīng)達到最大.當時間超過1.5 h后，細胞外側(cè)的濃度高于內(nèi)側(cè)的濃度，葉綠素由細胞外側(cè)向內(nèi)側(cè)擴散，脫除率下降，說明最適反應(yīng)時間為1.5 h.

圖3反應(yīng)時間對葉綠素提取率的影響 圖4反應(yīng)溫度對葉綠素提取率的影響

2.1.4 反應(yīng)溫度對小球藻粉葉綠素脫除率的影響

如圖4所示，在45 ℃的溫度下小球藻葉綠素脫除率較低，在45～60 ℃之間，葉綠素脫除率逐步提高，60 ℃時脫除率為95.50%,此后，葉綠素脫除率有下降的趨勢.葉綠素易溶于乙醇、丙酮等有機溶劑，不溶于水.本實驗所采用的脫色液(無水乙醇︰2%NaOH溶液=1︰4)中，無水乙醇作為萃取劑將水相中的葉綠素萃取至有機相,從而達到脫色的目的.但高溫會加速萃取劑的揮發(fā)，使得有機相含量降低，葉綠素被大量滯留在水相中，降低葉綠素的脫除率.因此，本實驗采用60 ℃為適宜溫度.

2.2 正交試驗

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用L9(34)的正交試驗表，選取料液比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、脫色液比例四個因素，每個因素選擇三個水平進行正交試驗，試驗結(jié)果見表2.

表2 正交試驗結(jié)果

由表2中的R值分析可知，對于葉綠素的提取，A、B、C、D因素對小球藻葉綠素脫除率的影響次序是A>C>B>D.料液比是重要因素，反應(yīng)溫度是一般因素，反應(yīng)時間和脫色液比例是次要因素，較優(yōu)組合為A1B2C2D3，即料液比1.5︰100(w/v)、反應(yīng)時間1.5 h、反應(yīng)溫度60 ℃、脫色液比例1︰6(v/v).選擇該自由組合條件進行3次驗證試驗，得出在該條件下小球藻葉綠素脫除率為96.89%(1±0.0035).與正交試驗中提取率最高的一組進行比較，可知小球藻葉綠素較佳脫除條件為A1B2C2D3，即料液比1.5︰100(w/v)、反應(yīng)時間1.5 h、反應(yīng)溫度60 ℃、脫色液比例1︰6(v/v).此條件下小球藻葉綠素的脫除率可達96.89%.對實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表3.

表3 方差分析表

由表3方差分析可以看出,反應(yīng)溫度因素的P=0.042<0.05，為顯著因素，料液比因素的P=0.000<0.01為極顯著因素，而提取時間和脫色液比例影響不顯著.

2.3 蛋白提取

在對小球藻蛋白質(zhì)提取進行前，采用凱氏定氮法測得小球藻蛋白的含量占58.60%(1±0.0057)，在脫除小球藻葉綠素的基礎(chǔ)上，利用熱堿法進一步提取小球藻蛋白，小球藻蛋白的提取率為39.81%(1±0.0021).

3 結(jié)論

實驗表明，影響小球藻葉綠素脫除率的各因素主次順序為：料液比>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時間>脫色液比例.較佳提取工藝條件為料液比1.5︰100(w/v)、反應(yīng)時間1.5 h、反應(yīng)溫度60 ℃、脫色液比例1︰6(v/v).在此條件下，測得葉綠素的實際脫除率為96.89%，與理論脫除率(96.73%)無顯著性差異.由此可知,通過正交實驗可以較好地預(yù)測試驗結(jié)果.在此基礎(chǔ)上，利用熱堿法提取小球藻蛋白，小球藻蛋白的提取率為39.81%.