王維釗， 朱沁玲， 向曉星， 馬 莉， 顧 達(dá)， 童 聰， 王婷婷，s何家俊， 劉 軍， 王 璐, 陳超伍

1 江蘇省蘇北人民醫(yī)院， 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 a.內(nèi)鏡診治中心； b.消化內(nèi)科； c.風(fēng)濕免疫檢測(cè)中心，江蘇 揚(yáng)州 225001； 2 大連醫(yī)科大學(xué) 研究生院， 遼寧 大連 116044

ExpressionandsignificanceofOX40/OX40Linperipheralbloodofpatientswithautoimmunehepatitis,primarybiliarycholangitis,andtheiroverlapsyndrome

WANGWeizhao1a,ZHUQinling1b,2,XIANGXiaoxing1b,MALi1b,GUDa1b,TONGCong1b,WANGTingting1b,2,HEJiajun1b,2,LIUJun1a,WANGLu1a，CHENChaowu1a.

(1.a.CenterofEndoscopicDiagnosisandTreatment,b.DepartmentofGastroenterology,c.CenterofRheumatologyandImmunology,SubeiPeople’sHospitalofJiangsu&ClinicalMedicalCollegeofYangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225001,China;2.GraduateSchool,DalianMedicalUniversity,Dalian,Liaoning116044,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of OX40/OX40L (CD134/CD134L) in CD4+T cells, CD8+T cells, monocytes, and B lymphocytes in peripheral blood of patients with autoimmune hepatitis (AIH), primary biliary cholangitis (PBC), and their overlap syndrome before and after standardized treatment.MethodsA total of 74 patients with AIH, PBC, and their overlap syndrome who were diagnosed in Subei People’s Hospital of Jiangsu from August 2015 to August 2019 were enrolled, and according to related diagnostic criteria, they were divided into AIH group (group A) with 29 patients, PBC group (group P) with 26 patients, and overlap syndrome group (group C) with 19 patients. A healthy control group with 30 individuals was also established. Peripheral blood samples were collected before and after standardized treatment to measure the expression of OX40/OX40L on the surface of peripheral blood cells by immunofluorescence flow cytometry, and the expression of OX40/OX40L was compared before and after treatment and between the three groups and the healthy control group to investigate its clinical significance. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant differencet-test was used for further comparison between two groups; the pairedt-test was used for comparison of paired samples between two groups.ResultsThere were no significant differences in sex composition and age composition between the three groups (P>0.05). Before treatment, the positive rate of OX40 in peripheral blood CD4+T cells gradually increased in groups A, P, and C, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate of OX40 than the control group (14.80%±4.99%/17.11%±2.71%/25.18%±5.55% vs 6.67%±2.26%,F=14.823,P<0.001); groups A, P, and C had a significantly higher positive rate of OX40 in CD8+T cells than the control group (4.86%±1.54%/6.40%±1.88%/7.33%±2.12% vs 4.09%±2.69%,F=5.486,P<0.001); the positive rate of OX40L in CD14+monocytes was 19.84%±6.11% in group A, 21.17%±4.35% in group P, 29.13%±6.32% in group C, and 4.86%±2.34% in the control group, and there was a significant difference between groups (F=17.004,P<0.001); the positive rate of OX40L in CD19+B cells was 17.62%±3.86% in group A, 14.75%±4.32% in group P, 10.13%±2.56% in group C, and 4.50%±1.38% in the control group, showing a trend of gradual reduction, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate than the control group (F=12.221,P<0.001). After treatment, the positive rate of OX40 in CD8+T cells decreased significantly to a similar level as the control group, and there was no significant difference between groups (F=0.731,P=0.538). For the other three types of cells, although there were varying degrees of reduction in the positive rate of OX40/OX40L after treatment, groups A, P, and C still had a significantly higher positive rate than the control group; in CD4+T cells, the positive rate of OX40 was 11.00%±1.98% in group A, 13.72%±1.03% in group P, 19.72%±3.47% in group C, and 6.67%±2.26% in the control group, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate than the control group (F=11.365,P<0.001); in CD14+monocytes, the positive rate of OX40L was 11.82%±2.23% in group A, 15.19%±4.42% in group P, 24.51%±4.09% in group C, and 4.86%±2.34% in the control group, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate than the control group (F=13.748,P<0.001); in CD19+B cells, the positive rate of OX40L was 9.09%±3.25% in group A, 6.81%±2.20% in group P, 7.48%±2.85% in group C, and 4.50%±1.38% in the control group, and groups A, P, and C had a significantly higher positive rate than the control group (F=8.052,P<0.001). Groups A, P, and C had significant reductions in the expression of OX40/OX40L in peripheral blood CD4+T cells, CD8+T cells, CD14+monocytes, and CD19+B lymphocytes after treatment (allP<0.05).ConclusionThe expression of OX40/OX40L in peripheral blood increases in patients with AIH, PBC, and their overlap syndrome and decreases after treatment, indicating that the OX40/OX40L pathway is involved in the pathogenesis of the above diseases, and the role of OX40 on the surface of CD8+T cells may better reflect the treatment outcome.

Keywords：hepatitis, autoimmune; primary biliary cholangitis; overlap syndrome; receptors, OX40; OX40 ligand

自身免疫性肝病是一組自身免疫功能紊亂導(dǎo)致的以肝臟為靶器官損害的自身免疫病，主要包括自身免疫性肝炎(AIH)、原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)，以及其重疊綜合征，多見(jiàn)于女性。其中AIH、PBC、AIH重疊PBC較為常見(jiàn)，目前此三種疾病發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，當(dāng)前的研究認(rèn)為其發(fā)病與免疫紊亂、遺傳、環(huán)境因素相關(guān)。T、B淋巴細(xì)胞的異常激活，及單核巨噬系統(tǒng)的活化，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)，B淋巴細(xì)胞異常分泌自身抗體，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)分泌炎性細(xì)胞因子，參與了其發(fā)病。而T淋巴細(xì)胞的活化需要第一與第二協(xié)同刺激信號(hào)及專職抗原遞呈細(xì)胞的參與[1-3]。OX40 (CD134)及其配體OX40L(CD252、CD134L)是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，它們的結(jié)合能為上述細(xì)胞活化提供協(xié)同刺激信號(hào)，其中，OX40表達(dá)于活化的CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞表面，OX40L主要表達(dá)于活化的B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。OX40/OX40L信號(hào)通路結(jié)合活化后，能促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞遷移、增殖、分化和記憶性CD4+T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，增強(qiáng)CD8+T淋巴細(xì)胞功能，而遷移的CD4+T淋巴細(xì)胞可輔助B淋巴細(xì)胞的成熟及自身抗體的產(chǎn)生，OX40/OX40L與多種自身免疫病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-7]，但目前尚缺乏OX40/OX40L在AIH、PBC及其重疊綜合征作用的相關(guān)研究，本研究通過(guò)檢測(cè)OX40/OX40L在上述3種疾病患者外周血淋巴單核細(xì)胞的表達(dá)，探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年8月-2019年8月在江蘇省蘇北人民醫(yī)院門診及住院就診的AIH、PBC及其重疊綜合征患者74例，留取患者外周血并按照各自診斷標(biāo)準(zhǔn)分為AIH組(A組，n=29)、PBC組(P組，n=26)、重疊綜合征組(C組，n=19)并隨訪，隨訪時(shí)間≥6個(gè)月，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)緩解后再次留取外周血(治療后A組、治療后P組、治療后C組)。其中AIH診斷標(biāo)準(zhǔn)參考國(guó)際自身免疫性肝病工作小組(IAIHG )2008年提出的AIH簡(jiǎn)化診斷積分系統(tǒng)[8]。PBC的診斷符合2015年由中華醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的《原發(fā)性膽汁性肝硬化(又名原發(fā)性膽汁性膽管炎)診斷和治療共識(shí)(2015)》[9]。重疊綜合征缺乏診斷標(biāo)準(zhǔn)，目前采用Chazouillères等[10]在1998年提出的巴黎標(biāo)準(zhǔn)，IAIHG于1999年提出修訂的診斷積分系統(tǒng)[11]。對(duì)于上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，有針對(duì)中國(guó)人群的研究[12]顯示, 使用巴黎標(biāo)準(zhǔn)診斷AIH-PBC重疊綜合征敏感度為20%，特異度為100%，修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷重疊綜合征，敏感度為60%，特異度為87.3%。使用2008年IAIHG 提出的簡(jiǎn)化AIH診斷積分系統(tǒng)聯(lián)合巴黎標(biāo)準(zhǔn)中PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷重疊綜合征，敏感度為90%，特異度為98.2%，并且操作簡(jiǎn)便。本研究采用簡(jiǎn)化積分系統(tǒng)診斷AIH-PBC重疊綜合征。由于AIH-PSC、PSC-PBC重疊發(fā)病率低，本研究未納入。同時(shí)設(shè)置健康對(duì)照30例，對(duì)照組選取蘇北人民醫(yī)院體檢中心健康體檢志愿者，均排除自身免疫性疾病，以及近期不存在感染、年齡和性別構(gòu)成與本研究相近患者。

1.2 實(shí)驗(yàn)資料 小鼠抗人單克隆抗體：CD4-PE、CD8-FITC、CD14-APC、CD19-FITC、OX40-APC、OX40L-PE購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司，紅細(xì)胞裂解液、流式細(xì)胞儀、離心機(jī)采用美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 (1)采集上述患者及對(duì)照組外周血2 ml，行EDTA抗凝；(2)取兩只流式細(xì)胞分析試管，分別加入全血50 μl，按照流式細(xì)胞抗體說(shuō)明書分別加入適量CD4-PE、CD8-FITC、OX40-APC，CD14-APC、CD19-FITC、OX40L-PE抗體，混勻后室溫避光孵育15 min，(3)加入裂紅素1 ml，充分震蕩，室溫避光孵育12 min，(4)1000 r/min離心5 min，棄上清；(5)加入PBS 500 μl震蕩混勻，1000 r/min離心5 min，棄上清；(6)加入PBS 200 μl，震蕩混勻，上機(jī)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 基本資料 A、P、C 3組患者女性比例分別為93.1%、88.4%、89.5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.442，P=0.47)。3組患者年齡分別為(54.74±8.36)歲、(54.43±9.71)歲、(51.1±6.7)歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.13，P=0.88)。

2.2 治療前OX40/OX40L表達(dá)水平 在CD4+T淋巴細(xì)胞中，C組OX40陽(yáng)性率最高[(25.18±5.55)%]，其次為P組[(17.11±2.71)%]，而A組最低[(14.80±4.99)%]，但均高于對(duì)照組[(6.67±2.26)%]，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.823，P<0.001)；在CD8+T淋巴細(xì)胞中，C組OX40陽(yáng)性率最高[(7.33±2.12)%]，其次為P組[(6.40±1.88)%]，而A組最低[(4.86±1.54)%]，但均高于對(duì)照組[(4.09±2.69)%]，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.486，P<0.001)；在CD14+單核細(xì)胞中亦發(fā)現(xiàn)同樣的規(guī)律，A、P和C組OX40L陽(yáng)性率依次為(19.84±6.11)%、(21.17±4.35)%和(29.13±6.32)%，均高于對(duì)照組[(4.86±2.34)%]，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.004，P<0.001)；但是在CD19+B淋巴細(xì)胞中，A、P和C組的OX40L陽(yáng)性率呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，分別為(17.62±3.86)%、(14.75±4.32)%和(10.13±2.56)%，均高于對(duì)照組[(4.50±1.38)%]，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.221，P<0.001)(圖1、2)。

2.3 治療后OX40/OX40L表達(dá)水平 經(jīng)治療實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)緩解后再次檢測(cè)，共成功隨訪63例患者，A組27例，P組22例，C組14例。在CD4+T淋巴細(xì)胞中，A、P、C組的OX40陽(yáng)性率依次為(11.00±1.98)%、(13.72±1.03)%和(19.72±3.47)%，均高于對(duì)照組[(6.67±2.26)%]，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.365，P<0.001)；在CD8+T淋巴細(xì)胞中， A、P、C組的OX40陽(yáng)性率依次為(3.72±1.78)%、(4.29±1.29)%和(5.08±2.46)%，接近于對(duì)照組水平[(4.09±2.69)%]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.731，P=0.538)。在CD14+單核細(xì)胞中，A、P、C組的OX40L陽(yáng)性率依次為(11.82±2.23)%、(15.19±4.42)%和(24.51±4.09)%，均高于對(duì)照組[(4.86±2.34)%]，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.748，P<0.001)；在CD19+B淋巴細(xì)胞中，A、P、C組的OX40L陽(yáng)性率依次為(9.09±3.25)%、(6.81±2.20)%和(7.48±2.85)%，均高于對(duì)照組[(4.50±1.38)%]，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.052，P<0.001)(圖1、3)。

2.4 治療前后OX40/OX40L表達(dá)比較 取成功隨訪患者治療前后數(shù)據(jù)比較，行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，A、P、C組OX40/OX40L在外周血CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD14+單核細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞的表達(dá)在治療后均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A組，t值分別為2.82、2.39、3.53、3.60，P值分別為0.013、0.030、0.008、0.006；P組，t值分別為3.51、3.02、2.48、3.71，P值分別為0.009、0.011、0.029、0.005；C組，t值分別3.01、2.06、2.80、2.17，P值分別為0.011、0.042、0.018、0.037)(圖2、3)。

3 討論

OX40/OX40L是英國(guó)牛津大學(xué)Paterson等[13]在1987年發(fā)現(xiàn)的小鼠活化CD4+T淋巴細(xì)胞表面的一種標(biāo)志物，命名為OX40。屬于腫瘤壞死因子受體超家族，相對(duì)分子質(zhì)量為50 000的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要在活化的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞上表達(dá)。其配體OX40L是相對(duì)分子質(zhì)量為34 000～40 000的Ⅱ型跨膜糖蛋白，可誘導(dǎo)性地表達(dá)于單核、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等專職的抗原遞呈細(xì)胞上。OX40/OX40L信號(hào)通路激活后，可促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞遷移、增殖、分化和記憶性CD4+T淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，而遷移的CD4+T淋巴細(xì)胞可輔助B淋巴細(xì)胞的成熟及自身抗體的產(chǎn)生，OX40/OX40L與多種自身免疫病(如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征等)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4,7,14]，目前有OX40/OX40L在多種自身免疫性疾病的作用研究，但在AIH、PBC及其重疊綜合征的研究尚缺乏，因此圍繞上述患者外周血OX40/OX40L的表達(dá)進(jìn)行研究，探討作用機(jī)制可能對(duì)開(kāi)發(fā)嶄新診治方案存在潛在價(jià)值[7,15]。

本研究3組患者均以50歲以上中年女性為主，性別年齡構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，和文獻(xiàn)[3,16]報(bào)道相符。本實(shí)驗(yàn)顯示OX40在AIH、PBC及其重疊綜合征患者的外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中高表達(dá)，且3組均較對(duì)照組明顯升高，經(jīng)治療后下降，但仍高于對(duì)照組，說(shuō)明在此3種疾病中，OX40在CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)活躍。經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，在AIH、PBC及其重疊綜合征患者中，發(fā)現(xiàn)各類型T淋巴細(xì)胞數(shù)量存在失衡(如Treg/Th17失衡)，功能紊亂，而總體CD4+T淋巴細(xì)胞功能是被強(qiáng)化的[17-18]。Webb等[19]的研究顯示在AIH、PBC及其重疊綜合征患者肝臟病理標(biāo)本上可見(jiàn)大量CD4+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，表明CD4+T淋巴細(xì)胞參與了其發(fā)病。Sitrin等[20]報(bào)道，OX40/OX40L結(jié)合活化后，可在功能上促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞活化增殖分化，對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞起到正向作用，并且發(fā)現(xiàn)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡及狼瘡性腎炎中，OX40/OX40L信號(hào)通路活化后可通過(guò)增強(qiáng)CD4+T淋巴細(xì)胞的功能加重疾病進(jìn)展。OX40/OX40L還通過(guò)增加OX40+CD4+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，產(chǎn)生高水平炎癥因子，加重類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，而抑制OX40通路后，促炎反應(yīng)被顯著降低[21]。本研究也顯示AIH、PBC及其重疊綜合征患者的OX40在CD4+T淋巴細(xì)胞中高表達(dá)，而經(jīng)糖皮質(zhì)激素、免疫抑制治療后，OX40表達(dá)顯著下降，表明在上述疾病中，CD4+T淋巴細(xì)胞功能活躍，并且OX40/OX40L是導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞功能強(qiáng)化，促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展的幕后有力助手之一，標(biāo)準(zhǔn)化治療能抑制OX40/OX40L在CD4+T淋巴細(xì)胞的作用，緩解該類患者病情。

本研究治療前CD8+T淋巴細(xì)胞的OX40陽(yáng)性率在AIH、PBC及其重疊綜合征患者中均高于對(duì)照組，其中C組最高；治療后3組OX40陽(yáng)性率均下降到健康人群相近水平，表明OX40在CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)經(jīng)治療后更容易下降。當(dāng)患者肝功能、免疫球蛋白經(jīng)治療后好轉(zhuǎn)時(shí)，OX40在CD8+T淋巴細(xì)胞的表達(dá)降至正常水平，說(shuō)明OX40/OX40L在CD8+T淋巴細(xì)胞的作用對(duì)治療更敏感，能更好的反應(yīng)療效。有研究[3]發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞在AIH、PBC及其重疊綜合征中發(fā)揮著重要作用。Miao等[22]研究顯示，AIH患者病理上可見(jiàn)大量CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并且可見(jiàn)大量肝細(xì)胞壞死，CD8+T淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。表明CD8+T淋巴細(xì)胞在其病程中發(fā)揮著重要作用。而OX40/OX40L如何作用于CD8+T淋巴細(xì)胞，在上述疾病中如何發(fā)揮作用，值得進(jìn)行更大樣本、更深入的研究。

CD14+單核細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞的OX40L陽(yáng)性率在AIH、PBC及其重疊綜合征患者中治療前后均比對(duì)照組高。治療前后AIH、PBC及其重疊綜合征患者的OX40L在CD14+單核細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞的表達(dá)均下降，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在免疫反應(yīng)中，單核巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞可作為專職抗原遞呈細(xì)胞，參與T淋巴細(xì)胞活化，為其提供活化信號(hào)，促進(jìn)免疫應(yīng)答，同時(shí)，也可分泌炎性細(xì)胞因子、抗體，參與免疫反應(yīng)。OX40/OX40L結(jié)合活化后，可增強(qiáng)CD4、CD8+T淋巴細(xì)胞的功能，同時(shí)活化的CD4+T淋巴細(xì)胞可輔助B淋巴細(xì)胞的成熟及自身抗體的產(chǎn)生[4]。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，AIH、PBC及其重疊綜合征患者體內(nèi)存在不同程度的IgG、IgM等免疫球蛋白升高[23-24]。本研究中上述患者外周血檢測(cè)OX40L在CD14+單核細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞表達(dá)較對(duì)照組升高明顯，而經(jīng)治療后下降。結(jié)合上述OX40的高表達(dá)情況，表明OX40/OX40L信號(hào)通路作用于CD14+單核細(xì)胞 、CD19+B淋巴細(xì)胞，為T淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化提供了協(xié)同刺激信號(hào)，而活化的T淋巴細(xì)胞，再次通過(guò)OX40/OX40L通路作用于CD14+單核細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)炎癥因子及自身抗體產(chǎn)生，參與AIH、PBC及其重疊綜合征的發(fā)病。

綜上所述，OX40/OX40L在AIH、PBC及其重疊綜合征患者外周血各細(xì)胞表達(dá)升高，經(jīng)治療后下降，參與了其發(fā)病機(jī)制。然而目前AIH、PBC及其重疊綜合征難以治愈，現(xiàn)有治療手段治療周期長(zhǎng)，需要長(zhǎng)期服藥，療效尚有很大的提升空間，在治療方法上，亟待全新的研究突破以及新的治療手段。因此，圍繞OX40/OX40L在上述疾病中的作用展開(kāi)深入研究，充分闡明其機(jī)制，以開(kāi)發(fā)出新的藥物，為該類患者的治療開(kāi)創(chuàng)嶄新的篇章。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：向曉星、馬莉主要負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿；王維釗、朱沁玲、馬莉主要負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)，完成實(shí)驗(yàn)，資料分析，撰寫論文并修改論文；顧達(dá)、童聰、王婷婷、何家俊、劉軍、王璐、陳超伍參與收集數(shù)據(jù)，修改論文。