劉巖巖 張 敏 李 紅 劉俊杰

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧沈陽110161）

黑木耳又稱木耳、光木耳、云耳、樹耳、木娥等，真菌學(xué)分類中屬擔(dān)子菌門、銀耳目、木耳科[1]。黑木耳是我國傳統(tǒng)的出口商品之一，目前我國的黑木耳年產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的90%以上。遼寧省是僅次于黑龍江、吉林的黑木耳生產(chǎn)大省，栽培品種黑29、8808、黑威系列、新科等多為野生種質(zhì)直接馴化而來，雜交品種的親本大多也是野生種質(zhì)。野生黑木耳具有分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)和抗性強(qiáng)等特點(diǎn)。野生黑木耳主要分布在黑龍江大興安嶺、小興安嶺，吉林長白山，遼寧東部山區(qū)，廣西的桂西、桂西北地區(qū)、陜西大巴山和秦嶺山脈、四川東部、西藏、新疆等地[2-3]，其經(jīng)過長期的進(jìn)化和演變積累了豐富的遺傳資源，遺傳多樣性好，彌補(bǔ)了栽培種質(zhì)遺傳背景單一的缺陷。黑木耳野生菌株的馴化，為黑木耳品種選育、復(fù)壯、改良提供了有效的生物資源，同時也為增加黑木耳的遺傳多樣性和創(chuàng)造新物種提供了可能[4]。

傳統(tǒng)的真菌分類主要按照真菌的子實(shí)體的形態(tài)、顏色、氣味以及孢子特征等。形態(tài)特征不僅容易受到生長環(huán)境的影響而表現(xiàn)出較大的差異，而且形態(tài)特征是易變的、模糊的，同時真菌的種類眾多，個體多態(tài)性強(qiáng)，因此傳統(tǒng)的分類學(xué)指標(biāo)常常會得到錯誤的結(jié)果。相反，以DNA 核苷酸序列為基礎(chǔ)的基因型則相對穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響，而且在生活史任何階段均可獲得，因而以DNA 分子序列進(jìn)行種類鑒定其結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠[5]。rDNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）位于核糖體 rDNA中，包括18S 和28S 基因之間的區(qū)域片段，由于ITS區(qū)域片段較小，長度一般為650～750 bp，易于分析，是中度保守的序列，其表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間具有高度特異性，且含有大量的通用引物。這些特征使ITS 在真菌物種的分類鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育研究應(yīng)用最為廣泛。因此筆者也用ITS 對黑木耳野生菌株進(jìn)行鑒定，為黑木耳的馴化栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生黑木耳菌株，來自遼寧省本溪市東營坊鄉(xiāng)老邊溝風(fēng)景區(qū)。對照菌株為：黑29、純黑山、黑威15，為遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

①綜合馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，MgSO42 g，KH2PO41.5 g，瓊脂18 g，自來水定容至1 000 mL，pH 自然。用于野生菌株的分離、鑒定及分離菌株母種的制備。②栽培料：木屑85.5%，麩皮10%，豆餅粉2%，石膏1%，石灰1.2%，磷酸二氫鉀0.3%，料含水量65%。用于分離菌株原種及栽培種的制備。

1.3 子實(shí)體形態(tài)觀察

取子實(shí)體完整部分，觀察并描述其表面性狀、結(jié)構(gòu)、顏色，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征初步鑒定。

1.4 野生菌株的分離及菌種的制備

用75%酒精棉球擦拭干耳片表面2～3 遍，將耳片四周邊緣剪去后，剪取遠(yuǎn)離耳基最平整部位的耳片0.5 cm×0.2 cm，用鑷子夾取該組織塊在酒精燈火焰外焰上方來回快速穿梭2～3 次（每次1～2 s）后，插入PDA 斜面培養(yǎng)基中。23 ℃避光培養(yǎng)，待長出菌絲后轉(zhuǎn)入空白PDA 斜面培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，獲得一級菌種即母種。

1.5 ITS測序及分析

1.5.1 DNA提取

取新鮮菌絲體0.3 g 左右，低溫充分研磨后，采用E.Z.N.A.Fungal DNA Kit 試劑盒提取總DNA，提取物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分裝后，于-20 ℃條件下保存[6]。

1.5.2 PCR擴(kuò)增

采用真菌通用引物（ITS1：5'-TCCGTAGGT?GAACCTGCGG-3' 和 ITS4：5'- TCCTCCGCTTATT?GATATGC-3'）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：總體積20 μL，其中2×Easy Taq Mix 10 μL，引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，30 個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送檢目的條帶進(jìn)行測序。測序公司：北京諾賽基因組研究中心有限公司，Sanger測序，雙向測序。將測序獲得的序列通過NCBI 進(jìn)行Blast 比對分析，分析同源性[7]。

1.5.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

應(yīng)用Mega 6.0 軟件，以Gene bank 中銀耳科盤革耳屬（Eichleriella deglubens）ITS 序列為聚類外群，bootstrap 次數(shù) 1 000，采用最大似然法（Maximum likelihood methods，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 拮抗試驗(yàn)

把分離菌株與主栽菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，3 個一組進(jìn)行組合，每個菌種用直徑0.5 cm 的打孔器打取3 個菌絲塊，交叉循環(huán)，設(shè)置3 個重復(fù)。每個平皿接種3 個菌株，按“品”字形排列。菌絲塊間距3 cm 左右，置于23 ℃，黑暗條件培養(yǎng)。觀察分離菌株與主栽菌株間拮抗線狀態(tài)，分析相互間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

1.7 菌絲培養(yǎng)特性研究

1.7.1 母種培養(yǎng)階段菌絲生長情況

將供試的菌株分別接到PDA 平板（直徑9 cm）培養(yǎng)基上，23 ℃避光培養(yǎng)，每天測定并記錄菌絲生長速度及長勢。

1.7.2 原種培養(yǎng)階段菌絲生長情況

將供試菌株母種接到原種培養(yǎng)基上，容器規(guī)格為500 mL 罐頭瓶。每個菌株100 瓶，23 ℃避光培養(yǎng)，每天測定并記錄菌絲定植及生長情況。

1.7.3 栽培種培養(yǎng)階段菌絲生長情況

將供試菌株原種接到栽培種培養(yǎng)基上，容器規(guī)格為17 cm×33 cm聚乙烯塑料袋。每個菌株200袋，23 ℃避光培養(yǎng)，每天測定并記錄菌絲定植及生長情況。

1.8 栽培特性研究

經(jīng)過后熟期的栽培種菌袋，采用露地全光標(biāo)準(zhǔn)栽培模式管理，定時扎眼、催芽。觀察記錄催芽情況、污染袋數(shù)、滿袋時間、子實(shí)體性狀及產(chǎn)量等。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實(shí)體形態(tài)特征

野生黑木耳菌株耳片深黑色，大部分耳狀，厚度0.7 cm 左右，邊緣圓正，少筋或無筋，干耳背面有纖毛，顏色灰白，稀疏。

圖1 野生黑木耳生態(tài)照

2.2 ITS序列擴(kuò)增

采用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行序列擴(kuò)增，均得到清晰的大小約為600 bp 的特異性條帶，這與Gen?Bank 中所報道的黑木耳ITS 序列長度基本一致，可以進(jìn)一步用于測序[8]。

圖2 ITS-PCR瓊脂糖電泳

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從聚類圖（圖3）可見，野生菌株 M 與LC373472.1（Auricularia villosula）的序列同源性較高，達(dá)100%。鑒定野生菌株為木耳屬[7]，黑木耳種。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 拮抗試驗(yàn)

由表1 可以看出，野生黑木耳菌株與對照菌株均有明顯的拮抗線，說明野生黑木耳菌株與本地主栽菌株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，排除菌種漂移的可能性，是新的種質(zhì)資源。

表1 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

圖4 供試黑木耳菌株拮抗?fàn)顟B(tài)

2.5 菌絲培養(yǎng)特性研究

2.5.1 母種培養(yǎng)階段菌絲生長情況

由表2可以看出，野生黑木耳菌株菌絲濃白，菌落邊緣整齊，無色素分泌，菌絲生長速度與其他三個主栽菌株無明顯差異。

表2 供試菌株在母種培養(yǎng)階段菌絲生長情況

2.5.2 原種培養(yǎng)階段菌絲生長情況

由表3可以看出，野生黑木耳菌株菌絲潔白，長勢濃密、粗壯，定植快，污染率較低，抗性強(qiáng)，菌絲生長速度與其他三個主栽菌株無明顯差異。

表3 供試菌株在原種培養(yǎng)階段菌絲生長情況

2.5.3 栽培種培養(yǎng)階段菌絲生長情況

由表4可以看出，野生黑木耳菌株菌絲潔白，長勢濃密、粗壯，定植快，污染率較低，抗性強(qiáng)，菌絲生長速度明顯快于黑威15，與其他兩個主栽菌株無明顯差異。

表4 供試菌株的栽培種培養(yǎng)階段菌絲生長情況

2.5.4 栽培特性研究

由表5可以看出，野生黑木耳菌株現(xiàn)耳時間短，出芽率較高，耳片單生，邊緣圓正，耳片厚，顏色深，產(chǎn)量高等優(yōu)良栽培性狀，為黑木耳品種選育、復(fù)壯、改良提供了新的種質(zhì)資源。

表5 供試菌株子實(shí)體的生長發(fā)育情況

3 小結(jié)

運(yùn)用ITS 分子標(biāo)記，成功地對一株野生黑木耳進(jìn)行鑒定，確定該野生菌株為木耳屬，黑木耳種，說明ITS 技術(shù)可以用來進(jìn)行黑木耳的種類鑒定。經(jīng)過鑒定的野生黑木耳菌株人工栽培獲得成功。研究為黑木耳品種選育、復(fù)壯、改良提供了新的種質(zhì)資源[9]。