顧文杰，朱 旗，舒春鴿，李 超，張 宇，薛洪寶,，高 敏，劉志祥

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院公共基礎(chǔ)學(xué)院，安徽蚌埠233030；2.安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)技術(shù)部，安徽蚌埠233045）

中醫(yī)藥典籍《中華本草》曰：豬苦膽自然陰干，陰陽(yáng)瓦微火焙干，研末沖服，具有清熱、潤(rùn)燥、解毒以及主熱病燥渴、大便秘結(jié)、咳嗽、哮喘、目赤、目翳、泄痢、黃疸、喉痹、聤耳、癰疽疔瘡、鼠瘺、濕疹、頭癬的功效。《本草綱目》《本草匯言》也有類似記載。膽色素為膽汁中的色素總稱，包括膽紅素和膽綠素，也是膽結(jié)石的主要成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1[1]。本實(shí)驗(yàn)以豬膽囊為原料提取膽紅素。

膽紅素（Bilirubin）作為豬膽囊中的主要成分，其分子是由四個(gè)吡咯環(huán)通過(guò)亞甲基和次甲基連在一起的開(kāi)鏈所組成的。血紅蛋白的原卟啉經(jīng)氧化使α-次甲基鍵斷開(kāi)，形成膽綠素，再經(jīng)還原為膽色素的其他成分。膽色素可以分為四類，即膽色烷、次甲膽色素、二次甲膽色素和三次甲膽色素，它們分別含有0、1、2 和3 個(gè)次甲橋。除膽色烷無(wú)色外，其他皆有顏色。膽紅素是二次甲膽色素，膽綠素為三次甲膽色素，圖1可反映其結(jié)構(gòu)。

膽紅素為橙色至暗紅棕色的粉末或結(jié)晶體[2-3]，加熱時(shí)逐漸變黑但不熔融。0.001%的氯仿溶液，在波長(zhǎng)400～490 nm 處有選擇性吸收，最大吸收波長(zhǎng)在449～451 nm 處。膽紅素具備多種藥理作用，是制造人工牛黃的主要原料，具有抗氧劑以及有效的過(guò)氧化氫基清除劑的功能，保護(hù)細(xì)胞膜脂質(zhì)免于活性基的氧化作用。膽紅素為干燥固體時(shí)較穩(wěn)定，在氯仿溶液中避光保存也較穩(wěn)定，在堿溶液中或遇Fe3+等極不穩(wěn)定，很容易被氧化。

膽紅素的主要來(lái)源及提取方法包括以下部分：從人的膽汁中提取膽紅素的直快法，因涉及到倫理道德方面，不為人類社會(huì)所允許；高分子樹(shù)脂型膽紅素常溫制取工藝方法，目前技術(shù)尚不成熟；狗、棕熊、活豬體等生物體引流提取膽紅素的方法涉及到傷害野生動(dòng)物方面，不為人類社會(huì)所允許；利用人的廢膽結(jié)石提取膽紅素的方法，由于利用人體病變組織，有感染其他病毒、細(xì)菌等風(fēng)險(xiǎn)，且涉及到倫理道德方面，亦不能推廣；酶法合成膽紅素，目前技術(shù)尚不成熟；豬、牛等家畜膽汁提取膽紅素的生產(chǎn)工藝是目前的主要來(lái)源途徑，且成本低廉[4-5]；此外，其他技術(shù)如雙管體內(nèi)合成膽紅素的技術(shù)、獺貍膽紅素和獺貍血紅素及其制取技術(shù)、血液分解法生產(chǎn)膽紅素新技術(shù)等受到成本較高、技術(shù)不成熟等因素限制，尚不能推廣。

圖1 膽色素化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of bile pigment

膽紅素不溶于水，溶于苯、氯仿、氯苯、二硫化碳，微溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，且分子中有兩個(gè)丙酸基側(cè)鏈，呈弱酸性，能與堿土金屬離子如Ca2+生成不溶性鹽（習(xí)慣上稱膽鈣鹽）。這種不溶性鹽與強(qiáng)酸如鹽酸反應(yīng)，可置換出膽紅素，這是本實(shí)驗(yàn)的主要提取方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器設(shè)備：DF-101S 型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；250 mL電熱套，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；水浴系列JC-ZFRE5000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，山東省青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵，河南省鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司。

試劑材料：豬膽囊，新采集或冰箱冷凍存放，安徽省某肉類聯(lián)合加工廠有限公司；氧化鈣，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；亞硫酸氫鈉，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；濃鹽酸，優(yōu)級(jí)純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；95%的乙醇，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；氯仿，分析純，河南祥德商貿(mào)有限公司；乙醚，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；純化水，電導(dǎo)率≥18 Ω。

1.2 工藝路線

提取工藝路線參照某公司原有豬胰臟來(lái)源膽紅素原料藥提取工藝基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，見(jiàn)圖2。

1.3 提取步驟

（1）制鈣鹽

取新鮮豬膽汁200 mL，加入3～4倍量的澄清飽和石灰水?dāng)嚢杈鶆?。加熱至沸，撇取浮于液面的橙紅色膽鈣鹽（內(nèi)含膽色素鈣鹽），趁熱壓干[6-7]。

（2）酸化

于鈣鹽中加入適量水，搗成糊狀，過(guò)65 目篩，加入1%的亞硫酸氫鈉[8]。在攪拌下緩緩滴加濃鹽酸溶液，至pH 值為1～2，靜置30 min。用雙層紗布瀝去酸水，得泥狀物。

（3）乙醇處理

泥狀物中加入95%的乙醇搗成稀糊狀，再加入約20 g 95%的乙醇和0.01 g亞硫酸氫鈉水溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆?。乙醇液的pH 值約在3.0～3.5。于約3℃靜置沉淀18 h。去除上層乙醇。于下層中加入45℃～50℃溫水，靜置分層，富集膽紅素的懸浮物即浮于液面[9]，去除下層廢水。

（4）提取

于懸浮物中加入氯仿約30 g，回流提取2 h。將提取液置于分液漏斗中分層，下層氯仿液過(guò)濾后，于常壓下蒸發(fā)出氯仿，盡量蒸干。于殘余物中加入適量95%乙醇，繼續(xù)蒸發(fā)至餾出乙醇中幾乎不帶氯仿氣味。過(guò)濾分取膽紅素，在過(guò)濾器上用溫?zé)岬囊掖己鸵颐严礈?，抽干，即得成品膽紅素[10-11]。

2 結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物呈橙色或淡黃色粉末，不溶于水，可溶于氯仿等有機(jī)溶劑，從物理化學(xué)性質(zhì)方面判斷與膽紅素性質(zhì)相同。

圖2 豬胰臟來(lái)源膽紅素原料藥提取工藝路線框圖Fig.2 Extraction process roadmap of bilirubin from pig pancreas

膽紅素和重氮化的對(duì)-氨基苯磺酸反應(yīng)，產(chǎn)生偶氮染料。這種偶氮染料在強(qiáng)酸中呈藍(lán)紫色，在pH 值2.0～5.5之間呈紅色，在pH值5.5以上則呈綠色。

（1）重氮化試劑的配制

溶液甲：對(duì)-氨基苯磺酸10 g，加濃鹽酸15 mL，水985 mL。

溶液乙：0.5%亞硝酸鈉溶液。

臨用時(shí)取10 mL甲溶液加0.3 mL乙溶液，混勻。

（2）膽紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[11-12]

精密稱取膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用氯仿溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，加氯仿至刻度。量取氯仿溶液10 mL，置于50 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，此即為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液膽紅素為0.000 02 g/mL。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于帶塞比色管中，分別加入乙醇9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL、4 mL，使總體積均為9 mL，再加入重氮化試劑1 mL，混勻。于20℃暗處?kù)o置60 min（或30℃暗處?kù)o置30 min）后，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸收度。以吸收度為縱坐標(biāo)，以各管中膽紅素的量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，見(jiàn)圖3。線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 99，線性方程：Y=1.020±0.035 46×X+0.028±0.013 81，檢測(cè)下限：1.38×10-7g/mL。

圖3 膽紅素含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of bilirubin content determination

（3）樣品測(cè)定[13]

另精密稱取供試品25.0 mg，用氯仿溶解后，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，邊加氯仿邊振搖，使溶解完全并加至刻度。量取氯仿溶液10 mL，置于50 mL 容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。精密量取5 mL于帶塞比色管中，加乙醇4 mL，使總體積為9 mL，混勻，再加入重氮化試劑1.0 mL。與標(biāo)準(zhǔn)品在相同條件下顯色后，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定吸收度?？捎蓸?biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的線性方程直接計(jì)算出供試品的含量。

3 結(jié)論

經(jīng)多次平行試驗(yàn)知，豬膽囊提取之前要保證新鮮，以免有效成分損失，提取過(guò)程中不能有鐵器接觸豬膽囊，以防產(chǎn)品氧化、變性，提取過(guò)程中使用的澄清石灰水在空氣中極容易變質(zhì)，使用時(shí)需現(xiàn)用現(xiàn)配，濃度過(guò)低或雜質(zhì)過(guò)多可能會(huì)導(dǎo)致鈣鹽不能全部漂浮出來(lái)，影響最終產(chǎn)品的收率。提取過(guò)程產(chǎn)生的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性物質(zhì)后處理不善可能會(huì)對(duì)環(huán)境造成不利影響[12]。在實(shí)驗(yàn)室小試階段過(guò)程中以濃鹽酸替代1∶1 的工業(yè)級(jí)鹽酸效果更佳。膽汁液沸騰后要立即趁熱過(guò)濾，因?yàn)槟戔}鹽的溶解度會(huì)隨溫度的升高而降低。如果溫度過(guò)低，橙紅色的膽鈣鹽溶解在溶液中，不易析出，導(dǎo)致成品產(chǎn)率較低。回流過(guò)程中要注意設(shè)備的密閉性，以防氯仿外泄；回流過(guò)程中不能完全蒸干，否則會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品過(guò)熱而分解變質(zhì)，收率明顯降低。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，以豬膽囊為原料生產(chǎn)膽紅素工藝技術(shù)路線可行，為肉類聯(lián)合加工企業(yè)的生產(chǎn)廢料——豬膽囊的無(wú)公害資源化處理，即以其為原料生產(chǎn)膽紅素提供了技術(shù)參考。