丁 璐 綜述， 程忠平 審校

(同濟大學附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072)

近年來，研究表明HPV與宮頸癌發(fā)病相關，目前已分離出200多種HPV病毒，并且根據(jù)其致病力及致癌作用將其分為高危型HPV和低危型HPV，其中部分HPV可以通過性接觸傳播[1]，HPV病毒具有嗜上皮特性，其感染宿主后可在表皮、生殖器、口腔黏膜等部位的上皮基底細胞中大量復制，當機體免疫力降低后可隨機整合到宿主基因組中，隨后沉默E2基因，從而減少其對E6、E7基因的抑制，使E6、E7蛋白過表達，輔以E5蛋白的表達，從而誘導感染細胞無限增殖甚至癌變。研究表明高危型HPV的持續(xù)感染與高級別子宮頸病變(high-grade intraepithelial lesion, HSIL)[2-3]及宮頸癌的發(fā)生密切相關[4]。研究發(fā)現(xiàn)，90%的宮頸癌與高危型HPV持續(xù)感染密切相關，其中HPV16、18型的相關度最高。宮頸癌在全球女性惡性腫瘤發(fā)病率中排名第4，在15～44歲女性惡性腫瘤發(fā)病率中高達第二[1,5-6]，是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，每年全球約有530000例的初診宮頸癌病例，其中約有130000例是中國人[7]。因此，研究HPV的結構及致瘤機制，對減少我國宮頸癌的發(fā)病率及降低死亡率尤為重要。

1 HPV結構

HPV是無包膜的具有嗜上皮性的雙鏈環(huán)狀DNA病毒(長度約8000bp)，病毒由核酸和衣殼蛋白組成，其中核酸為閉合環(huán)狀DNA基因組，可分為以下3個基因組區(qū)域[約10個開放閱讀框(open reading frame, ORF)]：早期編碼區(qū)(E區(qū))——編碼非結構蛋白；晚期編碼區(qū)(L區(qū))——編碼病毒粒子和病毒傳播所需的結構蛋白[8]，長調(diào)控區(qū)(long control region, LCR)——含有早期啟動子、調(diào)控病毒和細胞蛋白轉錄的調(diào)控位點[9]。

1.1 早期編碼區(qū)(E區(qū))

E區(qū)含E1、E2、E4、E5、E6、E7這6個早期基因，約占基因組的50%。E1、E2基因編碼E1、E2蛋白，調(diào)節(jié)病毒DNA的復制和轉錄，且E2蛋白在機體感染HPV病毒后可以維持胞內(nèi)轉運及感染細胞內(nèi)的DNA復制，此外合成的E2蛋白還可以抑制E6和E7基因的轉錄[10]。E4基因可以編碼產(chǎn)生E4蛋白，可以促進病毒的復制，并可以破壞細胞骨架，促進病毒粒子從受感染的上皮細胞內(nèi)逸出，向周圍組織擴散[11]。而E6、E7基因編碼產(chǎn)生的E6、E7蛋白作為主要的致癌蛋白，參與了細胞癌變的過程。E6蛋白主要與p53蛋白結合從而使p53失活，促進p53降解，誘使感染細胞維持在細胞周期S期；而E7蛋白則與視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, pRB)結合，使pRB失活，從而失去其對細胞周期的調(diào)控作用，誘導感染細胞向癌變方向發(fā)展[12]。E5蛋白可以與多種宿主細胞蛋白相互作用，最近有研究表明E5蛋白作為癌蛋白，可以刺激細胞增殖，抑制死亡受體誘導的細胞凋亡，以及調(diào)控與細胞黏附和免疫功能有關的基因復制和轉錄[13]。

1.2 晚期編碼區(qū)(L區(qū))

L區(qū)有L1、L2 2個晚期基因，約占基因組40%，分別編碼L1、L2蛋白。HPV的衣殼蛋白由主要蛋白L1和次要蛋白L2組成。電鏡三維結構顯示，HPV病毒是由72個五聚體構成的T=7的正20面體，在該結構中L2蛋白與L1蛋白以1∶5～1∶10的比列分布，每個五聚體由5個L1蛋白單體聚合而成，而L2蛋白則包埋于每個五聚體的中心區(qū)域[14]。L1蛋白可以自組裝成病毒樣顆粒(virus-like particle, VLPs)，可作為一種特異性免疫抗原，具有較高的免疫原性，可以誘發(fā)機體產(chǎn)生高低度的中和抗體和細胞免疫的表位，從而使細胞免受HPV病毒的再次攻擊[15]。L2蛋白包埋與每個五聚體的核心區(qū)域，只留N-末端殘基于五聚體表面，從而在細胞吸附和細胞復制過程中發(fā)揮作用，除此以外，L2蛋白還可在內(nèi)吞入胞、入核、囊泡轉運等過程中發(fā)揮一定作用[16]。

1.3 長控制區(qū)(LCR區(qū))

位于L1基因和E6基因間的非編碼區(qū)，約占整個病毒基因組的10%，可分為3個區(qū)段：5′區(qū)段、中心區(qū)段、3′區(qū)段。5′區(qū)段囊括第1個E2蛋白結合位點(E2bs)、轉錄終止和多腺苷酸化的結合位點。中心區(qū)段的兩端各有1個E2蛋白結合位點，中間是一些刺激或抑制病毒轉錄活動的基因序列，這些序列包括與AP1、NF1、TEF1、OCT1、YY1、BRN-3a、NF-IL6、KRF-1、NF-κB、FOXA1和GATA3等的結合位點。3’區(qū)段則有2個E2蛋白結合位點和一個E1蛋白結合位點(E1bs)，重疊在復制起源處。LCR區(qū)含有病毒轉錄、細胞蛋白翻譯的多個調(diào)控位點，從而調(diào)控早、晚期編碼區(qū)的基因轉錄和病毒顆粒的合成。

2 HPV致宮頸癌機制

HPV可以通過微小的皮膚損傷進入到上皮基底細胞中，在這些上皮基底細胞中只檢測到HPV DNA，沒有檢測到病毒衣殼蛋白，這表明在某些條件下HPV DNA可以目前尚未明確的機制隨機整合到宿主細胞基因組中，隨后干擾E2基因的表達，從而削減E2基因對E6、E7基因的負性調(diào)節(jié)作用，進一步抑制p53和pRB，促使感染細胞發(fā)生癌變[17]。據(jù)國內(nèi)外文獻報導，HPV感染細胞后誘發(fā)感染細胞癌變主要通過以下3種機制：宿主細胞基因組中病毒DNA的整合、E2基因的缺失或沉默、E6和E7基因的保留和過表達[18]，E5蛋白作為癌蛋白也參與了HPV感染細胞癌變的過程[13]。

2.1 HPV DNA在宿主細胞中的整合

近年來有研究表明，多數(shù)HPV感染是一過性的，一般在感染后6～12個月通過機體免疫系統(tǒng)作用會轉陰，但當機體免疫力下降或DNA發(fā)生突變后，部分亞型HPV DNA可隨機與感染細胞基因組發(fā)生整合，使細胞周期調(diào)節(jié)系統(tǒng)失控。因此，從宿主細胞感染HPV發(fā)展至宮頸癌，HPV DNA隨機整合到人類基因組中這一步驟必不可少[19-20]。在人類基因組中，HPV DNA可以與人類基因組中的各個DNA開放閱讀框發(fā)生隨機整合，但其中與結構不穩(wěn)定的染色體(如3q28、4q13.3、8q24.21、13q22.1和17q21或miRNA簇附近)發(fā)生整合的概率更高[21]。而對于HPV基因，其結構不穩(wěn)定的開放閱讀框更易與宿主基因組發(fā)生整合，而這些開放閱讀框中又以E2基因鉸鏈區(qū)結構最不穩(wěn)定，因此位于3132～3384 核苷酸位置的E2區(qū)是病毒與宿主基因組整合發(fā)生頻率最高的區(qū)域，也是整合過程中最常見的缺失或斷裂部位，亦為整合過程中HPV基因破壞最嚴重的區(qū)域[22]。E2基因負性調(diào)節(jié)E6及E7基因的表達，缺失或破壞E2基因，削減了E2基因對E6、E7基因的抑制作用，進而影響細胞的復制及轉錄過程。此外，HPV DNA與宿主細胞基因組整合后染色體可發(fā)生一定變化，如染色體易位、缺失甚至重排，增加了染色體結構的不穩(wěn)定性，當抑癌基因結構不穩(wěn)定后，細胞發(fā)生癌變的概率將大幅度上升[23]。除此以外，HPV DNA與宿主基因整合并不是致宮頸癌的唯一因素，HPV病毒基因高甲基化也會影響E2基因的轉錄，雖然沒有破壞E2基因的結構，但也間接影響了E6、E7基因的表達[24]。

2.2 缺失E2基因的表達

E2基因在病毒生命周期中發(fā)揮了很大的作用，E2基因具有1個DNA結合結構域和反式激活結構域，它們通過富含絲氨酸-精氨酸的鉸鏈區(qū)連接，E2基因編碼的E2蛋白通常與LCR中的同源序列E2結合位點(E2BS)結合形成同源二聚體，該二聚體中包含病毒早期啟動子、復制起點、增強子、多腺苷酸化位點等[25]。黏膜感染性HPV病毒具有4個E2BS，其中2個E2BS靠近病毒早期啟動子，第3個位于DNA復制起點，第4個位于增強子區(qū)域，E2蛋白與E2BS結合后會刺激或抑制E6、E7癌基因的表達，從而調(diào)控病毒的復制周期。已有證據(jù)表明，E2在控制病毒早期啟動子方面具有抑制功能。當E2蛋白濃度低時，E2將優(yōu)先與啟動子遠端2個E2BS結合，導致早期病毒蛋白E6、E7的產(chǎn)生增加。隨著E2蛋白濃度的增加，相對于啟動子遠端的2個E2BS，更多E2蛋白將與啟動子近端的2個E2BS結合，通過置換結合位點的特異性蛋白1(specificity protein 1, Sp1)和TATA結合蛋白(TATA-binding protein, TBP)使E6、E7的轉錄受抑制[26]。另一方面，E2可以與HPV復制過程中的解旋酶相互作用促進DNA復制。如2.1所提及，HPV的致癌過程與HPV病毒與宿主基因組整合密不可分，而與宿主基因組整合后，E2基因鉸鏈區(qū)是最常見的缺失或斷裂部位，因此整合后的宿主細胞內(nèi)E2蛋白的表達將大幅度減少，在此情況下，低度的E2蛋白將與啟動子遠端的2個E2BS結合，使E6、E7蛋白過表達，使感染細胞更易于傾向于永生化，癌變概率增加。

2.3 E6和E7基因的保留與過表達

2.3.1 E6基因 機體細胞通常受到一些內(nèi)源性因素(如細胞代謝、DNA復制及重組過程中出錯)和外源性因素(如紫外線及化學藥物作用)的影響，使細胞基因組受損，機體可通過復雜的網(wǎng)絡通路識別DNA損傷、激活細胞周期檢查點并促進DNA修復或清除機體里的高度損傷細胞[27]。而p53蛋白作為抑癌因子，參與了細胞內(nèi)的多個信號轉導過程，包括細胞增殖、DNA修復，必要時可終止細胞進程，誘發(fā)細胞凋亡[28]。因此，p53基因的沉默或突變可能會擾亂細胞內(nèi)信號轉導通路，使細胞生長、凋亡過程失控，從而誘發(fā)細胞癌變[29]。當DNA受損程度輕時，機體內(nèi)p53蛋白表達水平增高，使受損細胞停留在G1檢驗點，進行DNA修復，從而維持細胞基因組的完整性。當DNA修復失敗后p53蛋白則會啟動細胞凋亡通路，誘發(fā)細胞老化或凋亡，從而減少基因組突變發(fā)生的概率[30]。E6蛋白可以與多種宿主細胞蛋白相互作用，如p53，E6AP，MAML1，視網(wǎng)膜母細胞瘤家族蛋白和含鋅指結構蛋白，E6蛋白可使這些蛋白質(zhì)失活從而影響多種細胞途徑，如細胞增殖和凋亡。2016年1月，Nature雜志報道了法國斯特拉斯堡大學生物技術學院的Martinez-Zapien教授團隊關于HPV介導的p53降解所需的E6/E6AP/P53復合體的構建研究，他們在體外大腸桿菌BL21(DE3)細胞中分別表達了E6、E6AP及p53，在緩沖液B中以1∶1∶1的化學計量比混合，結晶濃縮后純化，獲得初始E6/E6AP/p53復合體晶體，在體外模擬了p53蛋白在復合體作用下降解的過程[31]。E6蛋白通過干擾p53蛋白的功能，誘導p53在蛋白酶依賴系統(tǒng)中的降解。HPV感染細胞內(nèi)E6蛋白持續(xù)高表達，過度表達的E6蛋白可與機體內(nèi)的E6相關蛋白(E6AP)結合，從而使E6AP與p53蛋白特異性結合。而E6AP又稱為泛素-蛋白連接酶(E3A)，與泛素結合后可以誘導p53在E3A系統(tǒng)里的過度降解。當p53蛋白過度降解后其作為抑癌因子作用大幅減弱，細胞DNA損傷時不能及時修復，亦不能及時啟動細胞凋亡通路，從而細胞基因組積累了大量突變基因，使細胞癌變概率增加[32-33]。此外，E6蛋白可通過與外源性的細胞凋亡途徑中的相關死亡域蛋白(Fas-associating protein with a novel death domain, FADD)及半胱氨酸蛋白酶-8相互作用抑制HPV感染細胞凋亡，使突變基因量進一步增多[34]。另一方面，E6蛋白與端粒酶活性的調(diào)節(jié)也有一定關系，有研究表明：與HPV有關的惡性腫瘤細胞中端粒酶的活性大于正常細胞，而端粒酶活性的高低與hTERT(催化亞基人端粒酶逆轉錄酶)的表達密切相關，而E6蛋白可以促進hTERT的轉錄。Myc鋅指蛋白(Maz)和hTERT上的啟動子結合后會抑制hTERT的表達，而E6蛋白可以抑制Maz蛋白活性，從而促進hTERT轉錄。鋅指轉錄因子Sp1結合hTERT啟動子后可以促進其表達，而E6蛋白可以促進Sp1與hTERT啟動子結合從而使端粒酶活性增高[35]。因此，E6蛋白的過表達可促使HPV感染細胞癌變。

2.3.2 E7基因 視網(wǎng)膜母細胞瘤基因(RB1基因)編碼視網(wǎng)膜母細胞瘤口袋蛋白(pRB蛋白)，pRB蛋白在細胞周期過程中起重要作用，pRB蛋白可與細胞周期調(diào)節(jié)因子(E2F)結合，抑制E2F轉錄活性，阻止細胞周期進入S期，從而使受損DNA得以修復，避免將突變基因傳遞給子代細胞。pRB還可參與調(diào)節(jié)DNA復制、細胞凋亡等過程[36]。HPV感染細胞E2基因表達受抑制，E7蛋白持續(xù)高表達，過度表達的E7蛋白能與pRb蛋白結合，從而抑制其與E2F因子結合，使E2F在細胞內(nèi)處于游離激活狀態(tài)，使得細胞在DNA受損條件下仍能向S期進展，細胞不斷增殖，使突變基因得以積累，從而誘導感染細胞癌變[37]。此外，E7蛋白還可與P107、P130蛋白結合，機制類似于pRb[38]，E7蛋白亦可拮抗細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)抑制物作用，促進CDK活化，推進細胞周期進入S期，促使細胞周期失去調(diào)控[39]。與E6蛋白對hTERT的誘導作用相似，E7蛋白雖不能直接調(diào)控端粒酶hTERT的表達，但E7蛋白與E6蛋白協(xié)同作用，可上調(diào)hTERT啟動子活性，從而增加hTERT轉錄，誘導HPV感染細胞無限增殖甚至永生化，進一步誘使細胞癌變。

2.4 E5基因

關于HPV致癌性和侵襲性的大多數(shù)研究都集中在E6和E7癌蛋白的作用上，但是，最近有研究表明，E5癌蛋白在HPV致癌過程中亦具有舉足輕重的作用[40]。E5癌蛋白可以通過與生長因子類受體如表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)結合形成活化復合物刺激細胞增殖，從而維持HPV感染細胞的持續(xù)增殖狀態(tài)[41]。E5癌蛋白主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中，E5蛋白可與其中的Ⅴ型ATP酶結合，減少內(nèi)體酸化作用，而內(nèi)體酸化是降解細胞表面受體的重要途徑。內(nèi)體酸化作用的失調(diào)會導致細胞表面受體(如EGFR)的代謝減少，從而增加其信號轉導活性。此外，E5癌蛋白還可以靶向下調(diào)角質(zhì)形成細胞生長因子受體/成纖維細胞生長因子受體2b(KGFR/FGFR2b)信號轉導，減少細胞的自噬過程。與E6癌蛋白類似，E5癌蛋白在抑制細胞凋亡方面也有一定作用，E5蛋白可以增加促凋亡蛋白Bax的泛素化和蛋白酶體的降解，從而抑制過氧化氫誘導的細胞凋亡，增加異常突變基因在細胞內(nèi)的積累，從而誘發(fā)感染細胞癌變。E5癌蛋白的另一重要作用就是對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，可與主要組織相容性復合體Ⅰ(major histocompatibility complex Ⅰ， MHC Ⅰ)相互作用，促進其在高爾基體中的保留，抑制其向細胞表面的轉運，從而使MHC I將病毒抗原呈遞給T細胞的能力降低。另外CD8+T細胞不能識別E5抗原，從而促進了HPV轉化細胞的免疫逃逸。因此，E5基因的表達促進了HPV感染細胞的癌變進程。

3 結 語

近年來宮頸癌的發(fā)病率逐漸上升，并且呈現(xiàn)逐漸年輕化的趨勢，嚴重威脅女性的生命安全。常規(guī)的治療方法(例如手術、化學療法和放射療法)仍是宮頸癌患者治療的主要手段，但治療后仍存在較高的復發(fā)率，降低了患者的生存率和生活質(zhì)量。近年來隨著科學技術的進步，逐漸發(fā)現(xiàn)了HPV中易與宿主基因隨機整合的為E2基因，缺失或破壞E2基因的表達，將會削弱E2基因表達產(chǎn)物對E6、E7基因表達的抑制，使得E6、E7基因過表達，繼而將會破壞相應的細胞內(nèi)信號傳導通路，輔以E5蛋白在調(diào)節(jié)免疫及細胞凋亡方面的協(xié)同作用，共同促進了HPV感染細胞的癌變過程。但目前仍有問題亟待解決，如HPV中E2基因與宿主基因整合的具體位點仍不明確，有待于進一步完善，E2基因具體通過何通路抑制E6、E7基因的表達以及E5如何與E6、E7基因協(xié)同作用抑制細胞凋亡、促進感染細胞癌變等問題仍有待于進一步研究與發(fā)現(xiàn)。因此更加深入的認識HPV結構及了解HPV各基因間的致癌作用及其在抑制細胞凋亡、促進細胞永生化方面的級聯(lián)作用機制仍是發(fā)現(xiàn)、診斷、治療及預防宮頸癌的關鍵所在。