方 晨 ，胡瑞舉，楊明華，張 斌，劉韶娜，郭 飛，黃 英，趙彥光*，趙素梅*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224）

斷奶仔豬腹瀉是由多種因素引起的急性、致死性傳染病。腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）F18 通過黏附于仔豬小腸黏膜上皮細(xì)胞的受體蛋白釋放腸毒素，引起仔豬斷奶前后腹瀉和水腫[1]。α（1，2）巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因1（α-1，2-Fucosyltransferase gene，F(xiàn)UT1）是調(diào)節(jié)大腸桿菌F18 黏附受體表達(dá)的一個(gè)候選基因，影響仔豬的腹瀉和水腫，位于豬6 號(hào)染色體的6q11 區(qū)段[2]。相關(guān)研究表明，F(xiàn)UT1基因與豬的產(chǎn)仔性能、發(fā)育性狀和腹瀉相關(guān)[3-9]。

迪慶藏豬是云南省優(yōu)良的地方品種，位于高原嚴(yán)寒地區(qū)，具有耐寒、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)以迪慶藏豬仔豬為研究對(duì)象，采用測(cè)序方法檢測(cè)FUT1基因，并研究分析FUT1基因編碼蛋白，為建立地方豬種抗病育種的候選基因及相關(guān)遺傳標(biāo)記和分子育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)于云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院養(yǎng)豬與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所豬場(chǎng)進(jìn)行，選取113 頭35 日齡體重8 kg左右的迪慶藏豬斷奶仔豬。

1.2 樣品采集 實(shí)驗(yàn)豬出生后一天內(nèi)采集耳組織，并放入裝有酒精的2 mL 離心管中，-80℃冰箱保存。

1.3 基因組DNA 提取 參照試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說明書提取DNA。采用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量，核酸濃度檢測(cè)儀測(cè)定基因組DNA濃度，并稀釋到50 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)豬FUT1基因全序列（GenBank登錄號(hào)：NC_010448.4），用Primer3 在線軟件（http://primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)引物，引物由Invitrogen公司合成（表1）。

1.5 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL：Template（10×）2 μL，上、下引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR Master Mix（10 mmol/L）12.5 μL（擎科生物有限公司），ddH2O 3.5 μL。PCR 產(chǎn)物由通用生物公司測(cè)序，F(xiàn)UT1基因PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)，72℃后延伸7 min 。

表1 FUT1 基因分段擴(kuò)增引物

1.6 生物信息學(xué)分析 將PCR 擴(kuò)增的FUT1基因6 段序列進(jìn)行拼接。應(yīng)用DNAMAN8.0 軟件翻譯FUT1基因序列，分析氨基酸突變。使用在線軟件ProParam 工具（https://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析；使用ProtScale 程序（https://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白疏水性；使用TMHMM2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白跨膜分析；使用NetPhot（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析蛋白磷酸化位點(diǎn)；使用NetNGlyc（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分析蛋白糖基化位點(diǎn)；使用SignalP 3.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）分析蛋白信號(hào)肽；使用PSIPED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析蛋白結(jié)構(gòu)域；使用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用DNAstar 軟件比對(duì)序列，DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，MEGA8.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。FUT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一、清晰明亮，與預(yù)期片段大小相符，符合DNA 測(cè)序的要求（圖1）。

2.2 氨基酸變異分析 將6 段測(cè)序序列拼接，得到FUT1基因全長(zhǎng)3 045 bp。通過比對(duì)迪慶藏豬FUT1 氨基酸變異位點(diǎn)與豬FUT1基因全序列（GenBank 登錄號(hào)：NC_010448.4），發(fā)現(xiàn)FUT1基因有7 個(gè)突變位點(diǎn)，其中C299T、C862G、C2418A、A306G 這4 個(gè)位點(diǎn)為錯(cuò)義突變（圖2）。

圖1 FUT1 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1FUT1基因編碼蛋白理化性質(zhì)FUT1基因編碼蛋白分子式為C4916H7548N1390O1353S46，共包含15 253 個(gè)原子，分子質(zhì)量約為109 ku，理論等電點(diǎn)pI 為9.21。在組成FUT1蛋白的20種氨基酸中，Leu所占的比例最高（11.4%），Tyr 所占比例最低（1.7%）。根據(jù)Guruprasad 方法，F(xiàn)UT1 蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為56.71，脂肪指數(shù)為75.23，說明FUT1 蛋白不穩(wěn)定。

圖2 氨基酸變異位點(diǎn)

2.3.2FUT1基因編碼蛋白疏水性分析 FUT1 蛋白的1～30 位、700～780 位極具親水性（圖3）?？傮w看來，F(xiàn)UT1基因編碼蛋白是親水性蛋白。

2.3.3FUT1基因編碼蛋白跨膜分析FUT1基因編碼殘基的所有氨基酸都位于細(xì)胞膜表面，與蛋白的疏水性區(qū)域結(jié)果分析基本一致，表明該蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)（圖4）。

圖3 FUT1 基因編碼蛋白親水/疏水曲線

圖4 FUT1 基因編碼蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3.4FUT1基因編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)分析 FUT1 編碼蛋白中發(fā)現(xiàn)58 個(gè)Ser、28 個(gè)Thr 和9 個(gè)Tyr 可能是磷酸化位點(diǎn)，真正的磷酸化位點(diǎn)還需要進(jìn)一步通過試驗(yàn)來確認(rèn)（圖5）。

圖5 FUT1 基因編碼蛋白中磷酸化位點(diǎn)

2.3.5FUT1基因編碼蛋白糖基化位點(diǎn)分析 FUT1 蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個(gè)典型的N 糖基化位點(diǎn)，分別位于136、195、694 位（圖6）。

2.3.6FUT1基因編碼蛋白的信號(hào)肽分析FUT1基因編碼蛋白不具有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（圖7 和圖8）。

2.3.7FUT1基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)FUT1基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋為主（圖9）。

2.3.8FUT1基因編碼蛋白超二級(jí)結(jié)構(gòu)—結(jié)構(gòu)域分析FUT1基因編碼蛋白第264～554 位是一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域——Glyco_transf_11，該結(jié)構(gòu)功能域具有結(jié)構(gòu)分子活性。

圖6 FUT1 基因編碼蛋白中糖基化位點(diǎn)

圖7 FUT1 基因編碼蛋白基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法預(yù)測(cè)結(jié)果

圖8 FUT1 基因編碼蛋白基于HMM 算法預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3.9FUT1基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析FUT1基因編碼蛋白的同源蛋白為c2hlhA，該蛋白屬于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（Nodulation Fucosy Ltrans Ferase）家族成員。目標(biāo)蛋白中有236 個(gè)殘基以100%的置信度建模。c2hlhA與提交的目的序列匹配性較好，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度為100%，該折疊子的X 射線晶體衍射結(jié)構(gòu)折疊識(shí)別出FUT1基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖10）。

2.4 不同物種FUT1基因比較及其系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載各物種FUT1基因序列。利用DNAMAN 8.0 軟件將迪慶藏豬分別與參考物種比對(duì)，結(jié)果顯示，迪慶藏豬與滇南小耳豬的同源性最高（99.8%），迪慶藏豬與人、小鼠、牛、黑猩猩、猴子、馬、狗、兔和中國樹鼩同源性分別為69.8%、59.4%、80.2%、69.5%、69.5%、79.3%、78.7%、67.2% 和70.2%（表2）。利用MAGE 8.0 軟件構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)迪慶藏豬與滇南小耳豬最先聚為一支，小鼠獨(dú)自為一支（圖11）。2 種分析結(jié)果均表明同一物種間親緣關(guān)系近，不同物種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不同物種間迪慶藏豬與牛的同源性最高，小鼠最低。

3 討 論

遺傳性抗病力可以發(fā)揮機(jī)體免疫抗病系統(tǒng)及其相互作用等多方面遺傳潛力?？共∮N指利用現(xiàn)有的品種資源，通過常規(guī)或分子育種的方法，培育抗病力強(qiáng)的新品種（系），選擇培育具有體貌特征好、抗病力強(qiáng)、遺傳性能好、適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性好的個(gè)體，經(jīng)若干世代的選育，最終培育出抗病力強(qiáng)的新品種（系）[12]。腹瀉是最常見、嚴(yán)重的仔豬疾病之一，也是引起斷奶仔豬死亡的重要原因，不但導(dǎo)致仔豬成活率降低，飼料報(bào)酬降低，生長(zhǎng)發(fā)育停滯甚至形成僵豬，而且會(huì)降低仔豬免疫力，繼發(fā)感染其他疾病，影響經(jīng)濟(jì)效益，威脅養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。吳圣龍等[13-14]證實(shí)FUT1基因的M307 位點(diǎn)多態(tài)性與斷奶仔豬腹瀉和水腫病存在直接的相關(guān)性，且抗病性AA 基因型不僅對(duì)斷奶仔豬腹瀉具有抗性，并具有較高的一般抗病性。周利華等[15]對(duì)10 個(gè)國內(nèi)外豬種FUT1基因新cSNPs 鑒別，并進(jìn)行仔豬抗大腸桿菌F18侵染研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M229C/T 和M714T/C 這2 個(gè)位點(diǎn)為錯(cuò)義突變，其中M229 位點(diǎn)可能是決定中國地方豬水腫與腹瀉病的變異位點(diǎn)。本研究也發(fā)現(xiàn)迪慶藏豬FUT1基因存在7 個(gè)突變位點(diǎn)，其中有4 個(gè)錯(cuò)義突變，包括已發(fā)現(xiàn)的C299T、A306G，以及新的C862G、C2418A，這或許與種質(zhì)資源或遺傳進(jìn)化相關(guān)。迪慶藏豬FUT1基因錯(cuò)義突變影響相關(guān)編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，可能導(dǎo)致迪慶藏豬產(chǎn)生耐嚴(yán)寒、抗逆性強(qiáng)等相關(guān)特性。

圖9 FUT1 基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖10 FUT1 基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

表2 不同物種FUT1 基因同源性比較

圖11 不同物種FUT1 基因進(jìn)化樹

目前關(guān)于豬FUT1基因的研究主要集中在仔豬腹瀉和生長(zhǎng)性能等方面[16-20]，生物信息學(xué)方面的研究尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，迪慶藏豬FUT1基因全長(zhǎng)3 045 bp，共編碼987 個(gè)氨基酸，F(xiàn)UT1基因編碼蛋白是一個(gè)親水不穩(wěn)定蛋白，沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。FUT1基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋為主，存在一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域Glyco_transf_11，并具有結(jié)構(gòu)分子活性。氨基酸在蛋白質(zhì)內(nèi)部，由于其疏水的相互作用，在保持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中起著重要作用。三級(jí)結(jié)構(gòu)分析目標(biāo)蛋白中有236 個(gè)殘基以高置信度建模，c2hlhA 與目的序列匹配性較好，預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度高。從物種遺傳進(jìn)化方面看，各物種FUT1基因序列各不相同。同一物種間迪慶藏豬FUT1基因與滇南小耳豬的同源性高達(dá)99.8%，但也存在差異，不同物種間FUT1基因突變差異較大，親緣關(guān)系遠(yuǎn)，這可能與物種進(jìn)化或自然環(huán)境有關(guān)。

4 結(jié) 論

迪慶藏豬FUT1基因共有7 個(gè)突變位點(diǎn)，其中4 個(gè)為錯(cuò)義突變。在FUT1基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)方面，F(xiàn)UT1蛋白是一個(gè)親水性不穩(wěn)定蛋白，不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，有95 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)和3 個(gè)N 糖基化位點(diǎn)，1 個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域Glyco_transf_11，同源蛋白c2hlhA 匹配性較好。在物種遺傳進(jìn)化方面，迪慶藏豬與滇南小耳豬親緣關(guān)系近，與其他物種親緣關(guān)系遠(yuǎn)。