樊慶燦

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000）

性別比指的是出雛個(gè)體中的雄雌比例[1]，這對家禽的工業(yè)化生產(chǎn)極為重要。在家雞（Gallus gallus）生產(chǎn)中，若種雞和蛋雞中的雄性比例偏高，需要處理的雄性數(shù)目更多，用于生產(chǎn)的雌性個(gè)體數(shù)相應(yīng)減少，就會(huì)極大地影響家禽生產(chǎn)效益[2]。研究發(fā)現(xiàn)在不同環(huán)境和飼養(yǎng)條件下，家禽的雌雄比例并不是理論中的1:1，母代會(huì)根據(jù)生長環(huán)境和自身狀況對后代比例做出適當(dāng)調(diào)整，生產(chǎn)出較多對生活環(huán)境適應(yīng)度更好的性別后代，使其有更多的繁殖機(jī)會(huì)，從而出現(xiàn)性別偏移[3-4]。

與哺乳動(dòng)物不同，禽類雌性染色體類型是ZW 型，卵母細(xì)胞中的性染色體決定子代性別[5]。在禽類雌性生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂過程中，一組染色體會(huì)以極體的形式排出體外，另一組染色體會(huì)被保留并最終形成卵母細(xì)胞，這一過程決定子代性別比例[6]。目前研究認(rèn)為影響禽類性別分配現(xiàn)象的因素有母禽的自主調(diào)節(jié)[1]、卵黃內(nèi)固醇類激素比例[7]、卵黃沉積速度[8]和精子的選擇[5]等，這些因素均是從卵母細(xì)胞形成及受精的外環(huán)境角度出發(fā)。由于禽類生理活動(dòng)的復(fù)雜性，難以精確控制機(jī)體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行深入研究。在這一方面，分子研究具有獨(dú)特的優(yōu)勢，外環(huán)境的變化是通過特定基因表達(dá)量的變化來體現(xiàn)的。雞的減數(shù)分裂發(fā)生在排卵前，Aslam等[9]利用雞排卵前的胚盤，檢測Z 和W 型配子形成過程中的基因表達(dá)差異，篩選出一些細(xì)胞周期和減數(shù)分裂有關(guān)的基因集。本研究利用其中數(shù)據(jù)（GSE59041）和生物信息技術(shù)，篩選Z 和W 卵泡胚盤差異表達(dá)基因，探討基因功能，為其他禽類性別偏移的研究提供一些思路。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及背景 本研究所用數(shù)據(jù)（GSE59041）來自于基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GSE），由Aslam 等[9]上傳，該研究利用海賽克斯褐色蛋雞排卵前卵泡的胚盤，檢測Z 和W 型卵泡減數(shù)分裂過程中的相關(guān)基因表達(dá)量[9]。本研究選擇8 個(gè)樣本的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析（表1）。

表1 8 個(gè)樣本信息統(tǒng)計(jì)表

1.2 分析軟件及步驟 在GEO 數(shù)據(jù)庫中查找編號GSE59041 的樣品信息，下載Matrix 數(shù)據(jù)文件，根據(jù)表1 設(shè)定分組，利用R3.6.0 進(jìn)行表達(dá)量數(shù)據(jù)log 轉(zhuǎn)換并繪制箱線圖，R 軟件Bioconductor 包進(jìn)行差異分析。將P＜0.01 且log FC＞1 的基因編號導(dǎo)入DAVID 6.8 中轉(zhuǎn)化為Official Gene Symbol，將基因?qū)氲絊TRING（https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=NPdugdyy2MoP&input_page_ show_search=on）中進(jìn)行互作分析，將combinescore＞0.7 的互作數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape3.6.1 中，繪制基因互作圖。利用Cytoscape 中cytoHubba 插件Betweenness算法篩選5 個(gè)核心基因，BINGO 插件進(jìn)行基因富集分析并繪制樹狀圖。利用DAVID 對顯著基因進(jìn)行基因通路分析。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化 由圖1 可知，8 個(gè)樣本在標(biāo)準(zhǔn)化之后，下四分之一值、上四分之一值、中位數(shù)分別為（4.36±0.02）、（9.47±0.01）、（6.61±0.00），樣本數(shù)據(jù)之間差異較小，可以進(jìn)行表達(dá)譜數(shù)據(jù)的差異分析。

圖1 樣本數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的統(tǒng)計(jì)信息

2.2 差異表達(dá)基因 本研究共篩選出239 個(gè)在Z 和W 型卵泡胚盤中表達(dá)差異顯著的基因（P＜0.01）。Z 與W 相比，基因表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)為191 個(gè)，下調(diào)基因數(shù)為48 個(gè)。表2 列出P＜0.000 1 的6 個(gè)基因，差異最為顯著的基因?yàn)榻佑|蛋白1（Contactin 1，CNTN1），其次為乙狀同源盒（Goosecoid Homeobox，GSC）、成纖維細(xì)胞生長因子8（Fibroblast Growth Factor 8，F(xiàn)GF8）、纖毛和鞭毛相關(guān)蛋白74（Cilia And Flagella Associated Protein 74，CFAP74）、免疫球蛋白超家族成員21（Immunoglobin Superfamily Member 21，IGSF21）和驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員23（Kinesin Family Member 23，KIF23），CNTN1在雞Z 型卵泡的胚盤中表達(dá)下調(diào)，另外5 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。利用Betweenness 算法篩選的5 個(gè)核心基因見圖2，分別為合子阻滯基因1（Zygote arrest 1 like，ZAR1L）、周期蛋白依賴性激酶1（Cyclin Dependent Kinase 1，CDK1）、細(xì)胞分裂周期蛋白20（Cell Division Cycle 20，CDC20） 和RAD51 重 組 酶（RAD51 Recombinase，RAD51），這些基因間存在互作關(guān)系。

表2 P＜0.0001 的差異表達(dá)基因

圖2 核心基因的互作圖

圖3 基因富集分析樹狀圖

2.3 基因富集分析 對篩選到的239 個(gè)基因進(jìn)行功能富集分析（圖3），共篩選到3 個(gè)方向18 個(gè)顯著條目（P＜0.05）：DNA 復(fù)制和裝配；細(xì)胞周期；基因表達(dá)和細(xì)胞生物合成。其中DNA 復(fù)制和裝配方向富集到11個(gè)條目。基因表達(dá)和細(xì)胞生物合成方向6 個(gè)條目，細(xì)胞周期方向只有1 個(gè)條目。所有條目中，DNA 構(gòu)象變化（DNA Conformation Change）是P值最小的條目。細(xì)胞內(nèi)生物過程調(diào)控（Regulation of Cellular Process）是基因數(shù)最多的條目（18 個(gè)）。P最小的6 個(gè)基因中，GSC基因富集在6 個(gè)條目中，F(xiàn)GF8基因富集在3 個(gè)條目，均屬于基因表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)生物合成方向。核心基因RAD51富集在細(xì)胞周期和DNA 復(fù)制、裝配方向的6 個(gè)條目中。

2.4 信號通路分析 將篩選到的基因進(jìn)行信號通路分析（圖4），共篩選到6 個(gè)顯著信號通路（P＜0.05），其中細(xì)胞周期（04110）信號通路是P值最小且參與基因數(shù)最多的信號通路。另外5 個(gè)通路包括同源重組（03440）、間隙連接（04540）、DNA 復(fù)制（03030）、p53（04115）和范可尼貧血（03460）信號通路，參與基因數(shù)分別為5、8、5、6、5 個(gè)。核心基因CDK1參與細(xì)胞周期、間隙連接和p53 信號通路，CDC20參與細(xì)胞周期信號通路，RAD51參與同源重組和范可尼貧血信號通路。

圖4 基因信號通路分析統(tǒng)計(jì)圖

3 討 論

3.1 差異表達(dá)基因分析 本研究篩選到239 個(gè)基因，其中191 個(gè)基因在含有Z 染色體的胚盤中表達(dá)上調(diào)。鳥類性染色體中，Z 染色體為大染色體，含有較多的基因[10]，可能在Z 型卵母細(xì)胞形成過程中需要更多基因進(jìn)行協(xié)調(diào)，保障受精及胚胎發(fā)育的正常進(jìn)行。富集分析發(fā)現(xiàn)基因主要富集在3 個(gè)方向：基因復(fù)制和裝配、基因表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)生物合成、細(xì)胞周期，這與減數(shù)分裂過程也是吻合的。減數(shù)分裂過程中發(fā)生染色體復(fù)制和大量的生物合成[11]，細(xì)胞周期基因能夠促進(jìn)并維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的正常進(jìn)行[12]，這些基因在不同配子形成過程中，表達(dá)量會(huì)存在一定差異。信號通路分析中，細(xì)胞周期信號通路是參與基因數(shù)最多且最顯著的通路，也說明細(xì)胞周期因子在雞卵母細(xì)胞形成中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，是雞性別決定時(shí)期的調(diào)控因子，其關(guān)鍵基因表達(dá)量的差異可能導(dǎo)致性別偏移。另外一些信號通路包括DNA 重組和復(fù)制、細(xì)胞凋亡、信號傳導(dǎo)，這與富集分析結(jié)果也是一致的。

3.2 重要基因功能分析 本研究篩選的P＜0.0001 和核心基因中，F(xiàn)GF8、CDC20、CDK1和ZAR1L與卵母細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞周期相關(guān)。FGF8基因是成纖維細(xì)胞生長因子家族中的一員，該家族基因在卵泡發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)FGF8基因能激活原始卵泡[14]、促進(jìn)顆粒細(xì)胞雌激素分泌和卵丘擴(kuò)散[15]。該基因通過MAPK/ERK 信號傳導(dǎo)激活并調(diào)控原始生殖細(xì)胞的發(fā)育[16-17]?；蚣易宄蓡TFGF9的缺失導(dǎo)致大鼠胚胎性別反轉(zhuǎn)[18]。CDC20基因通過激活周期體APC/C 保障有絲分裂中期到后期的有序進(jìn)行，并在有絲分裂到減數(shù)分裂轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要的作用[19]。APC/CCDC20在減數(shù)分裂Ⅰ中期、末期和減數(shù)分裂Ⅱ中期的“失活-活化-再失活”調(diào)節(jié)減數(shù)分裂的進(jìn)行[20]。CDK1基因在細(xì)胞周期的G2/M 期的激活中具有重要調(diào)控作用[21]，CDK1 蛋白與CCNB1 蛋白的結(jié)合形成細(xì)胞促分裂因子（Maturation Promoting Factor,MPF），促進(jìn)生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂和配子的形成[22]。CDC20基因和CDK1基因參與動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)控，其表達(dá)差異可能對禽類性別偏移發(fā)揮一定的作用，但目前并未有相關(guān)報(bào)道。

ZAR1L與ZAR1基因高度同源，尤其是C 末端RNA結(jié)合域序列。ZAR1基因是母性效應(yīng)基因，即母體基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 儲存在生殖細(xì)胞中，在胚胎基因激活前調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、配子生成和早期胚胎發(fā)生[23]。在小鼠中，ZAR1-/-雌鼠不孕，胚胎發(fā)生在1-細(xì)胞期受阻[24]。在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中，ZAR1基因和ZAR1L基因通過調(diào)節(jié)母細(xì)胞mRNA 翻譯激活而發(fā)揮作用，ZAR1/ZAR1L基因缺失的小鼠卵母細(xì)胞中母源基因蛋白合成減少，減數(shù)分裂恢復(fù)延遲和紡錘體形成異常發(fā)生率較高[25]。另有研究發(fā)現(xiàn)，缺少ZAR1的雌性斑馬魚，透明帶糖蛋白過量積累引起卵母細(xì)胞凋亡，性別反轉(zhuǎn)為雄性[26]。Zar1基因和Zar1L基因主要在雞的卵母細(xì)胞、胚胎和成年雞的性腺中共表達(dá)[27]。對于禽類來講，母代會(huì)根據(jù)自身狀況調(diào)整后代性別比例，母體效應(yīng)基因是相對合理的調(diào)節(jié)方式。綜上所述，ZAR1/ZAR1L 蛋白可能和CCNB1、CDK1 等細(xì)胞周期蛋白協(xié)同作用，影響禽類性別偏移。

4 結(jié) 論

本研究利用雞Z 和W 卵泡胚盤的測序數(shù)據(jù)，篩選生殖細(xì)胞減數(shù)分裂過程中影響雞性別偏移的基因，共發(fā)現(xiàn)239 個(gè)基因，主要富集在DNA 復(fù)制和裝配、細(xì)胞周期、基因表達(dá)和細(xì)胞生物合成3 個(gè)方向，并參與細(xì)胞周期、基因重組、p53 和間隙連接等信號通路。基因FGF8、CDC20、CDK1和母性效應(yīng)基因ZAR1L可能在雞性別偏移中發(fā)揮一定的作用。