羅 韋 ，李 輝*，陳 林，葉 濤，肖 濤，黃錫陽(yáng)，司宗貴，周 迪，張小玉

（1.高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；4.貴州竹香雞養(yǎng)殖有限公司，貴州遵義 564708；5.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州貴陽(yáng) 550025）

腱蛋白樣蛋白1（Chordin-Like1，CHRDL1）基因位于雞的4 號(hào)染色體上，是一種分泌性骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）拮抗劑[1]。BMPs 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族中的一員[2]，其中BMP4 與誘導(dǎo)胚胎分化、指導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，BMP4 在造血組織、皮膚附屬物形成和分化以及腎臟、肝臟及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起一定的作用[4]，BMP4基因在小鼠卵巢組織中高表達(dá)，可促進(jìn)原始卵泡的發(fā)育以及向初級(jí)卵泡轉(zhuǎn)化[5]。在對(duì)雞BMP4的基因結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，BMP4具有信號(hào)肽和潛在的糖基化、磷酸化位點(diǎn)，表明該生長(zhǎng)因子在原始卵泡發(fā)育、早期胚胎發(fā)育中有著重要作用[6]。喻世剛等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CHRDL1基因與沐川黑雞膚色性狀相關(guān)，且其SNP 位點(diǎn)c.-949T＞C 與膚色呈顯著相關(guān)。目前，關(guān)于CHRDL1基因的研究鮮有報(bào)道。

赤水烏骨雞主要分布于“楠竹之鄉(xiāng)”赤水市，該雞具有產(chǎn)綠殼蛋、耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)等特性[8]。綠殼蛋具有低膽固醇、低脂肪、富含硒和鋅等特點(diǎn)[9]，受到越來(lái)越多的關(guān)注。陳林[10]對(duì)360 日齡赤水烏骨雞蛋殼腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，CHRDL1基因?yàn)榈皻ゎ伾顪\的下調(diào)基因，雖然已確定SLCO1B3基因?yàn)榫G殼蛋的綠殼主效基因，在實(shí)際生產(chǎn)中盡管純合子的綠殼蛋雞都產(chǎn)綠殼蛋，但蛋殼的綠色程度深淺不一[11]。為探究CHRDL1基因?qū)Φ皻ぞG色的影響，本研究檢測(cè)不同產(chǎn)蛋期赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中CHRDL1基因的表達(dá)量，以豐富綠殼基因的研究結(jié)果，為赤水烏骨雞的選育提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取180、360、540 日齡的赤水烏骨雞母雞各100 只，根據(jù)基因型和蛋殼顏色分為6 類：純合型深綠色、純合型淺綠色、純合型淡綠色、雜合型深綠色、雜合型淺綠色、雜合型淡綠色。每種類型各個(gè)產(chǎn)蛋期隨機(jī)選取3 只母雞，共54 只，在其產(chǎn)蛋前2.5～3 h 屠宰，采集肝臟和蛋殼腺。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 在GenBank 中檢索到CHRDL1基因和SLCO1B3基因的mRNA 序列分別是NM_204171.1和NM_001318449.1，利用Primer Premier 5 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由貴陽(yáng)春滿谷生物科技有限公司合成，具體信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.2.2 綠殼基因分型 采集180、360、540 日齡赤水烏骨雞母雞各100 只血液2～3 mL，翅下采血，EDTA 抗凝，使用血液基因組DNA 提取試劑盒（購(gòu)自北京天根生化科技有限公司）提取血樣中的DNA，采用雙重PCR 對(duì)SLCO1B3基因進(jìn)行分型，分為綠殼純合型、綠殼雜合型和純合非綠殼。雙重PCR 反應(yīng)體系為（20 μL）：Taq PCR Mastermix（購(gòu)自北京天根生化科技有限公司）10 μL（0.1 U/μL），上下游引物各 1 μL（10 μmol/L），DNA 模板1 μL（200 ng/μL），加ddH2O 補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，35 個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s、51.3℃退火40 s、72℃延伸40 s），72℃延伸10 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察基因型。

連續(xù)7 d 觀察各日齡純合型和雜合型母雞每天所產(chǎn)蛋的顏色，將產(chǎn)蛋顏色均勻的母雞做好標(biāo)記，并收集180 日齡純合型和雜合型產(chǎn)蛋顏色均勻的母雞所產(chǎn)的蛋，測(cè)其蛋殼中膽綠素的含量，并按照蛋殼中膽綠素含量的高低將綠殼蛋分為深綠色、淺綠色、淡綠色，并以此作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分類的參照，結(jié)合基因型和蛋殼顏色將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為純合型深綠色、純合型淺綠色、純合型淡綠色、雜合型深綠色、雜合型淺綠色、雜合型淡綠色6 類。

蛋殼膽綠素測(cè)定方法參考劉敬壽[12]和卜小雁[13]的方法。稱取原卟啉36 mg、膽綠素26 mg 溶解于6 mL溶劑中，溶劑由濃鹽酸和甲醇按1:2 的比例配制而成，漩渦振蕩，避光保存18 h，分別制成原卟啉和膽綠素的標(biāo)準(zhǔn)原液[11]。將原液稀釋成8、16、32、64、128、256、512 倍，利用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定在412 nm和680 nm 處蛋殼溶解液的吸光值[12]。測(cè)定不同綠色深淺蛋殼中膽綠素含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，膽綠素含量越高其蛋殼綠色越深。周玉[14]研究發(fā)現(xiàn)，可以采用NR 型蛋殼顏色色差計(jì)測(cè)量蛋殼顏色，不同綠色深淺的蛋殼其數(shù)值不同，蛋殼綠色越深其數(shù)值越小。

1.2.3 RNA 的提取 采集不同產(chǎn)蛋期的赤水烏骨雞的蛋殼腺和肝臟，采用Trizol 法提取組織樣的總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，OD260/OD280的比值介于1.9～2.1之間，平均濃度達(dá)到3 000 ng/μL，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增體系及程序 為測(cè)定不同產(chǎn)蛋期的赤水烏骨雞蛋殼腺和肝臟中CHRDL1基因的表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法測(cè)定，反應(yīng)體系采用20 μL 體系：SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）10 μL（1 x），上下游引物各0.6 μL（10 μmol/L），cDNA 1 μL（1 000 ng/μL），ddH2O 7.8 μL；反應(yīng)條件按照SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 運(yùn)用SPSS 22.0 軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。表中數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1SLCO1B3基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果 檢測(cè)結(jié)果如圖1 所示，綠殼純合子（SL/SL）產(chǎn)物片段大小為884 bp，綠殼雜合子（SL/W）產(chǎn)物片段大小為884 bp 和732 bp，非綠殼純合子（W/W）產(chǎn)物片段大小為732 bp。3 種基因型的凝膠電泳產(chǎn)物片段大小與目的片段大小一致，表明該分型結(jié)果可以用于赤水烏骨雞的基因分型。

圖1 SLCO1B3 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果圖

2.2 蛋殼膽綠素含量分析 由表2 可知，180 日齡時(shí)，基因型相同時(shí)，深綠色的蛋殼膽綠素含量極顯著高于淺綠色及淡綠色，淺綠色的蛋殼膽綠素含量極顯著高于淡綠色。相同蛋殼顏色的情況下，純合型與雜合型間膽綠素含量不存在顯著差異，但是純合型的蛋殼膽綠素含量略高于雜合型。對(duì)CHRDL1基因的表達(dá)量與蛋殼中膽綠素含量進(jìn)行相關(guān)系數(shù)計(jì)算，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)為-0.888 3，呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表2 180 日齡不同綠色蛋殼的膽綠素含量

2.3CHRDL1基因的差異表達(dá)分析

2.3.1 赤水烏骨雞蛋殼腺中CHRDL1基因的表達(dá)情況CHRDL1基因在蛋殼腺中不同顏色間的表達(dá)情況如表3所示，180 日齡時(shí)，純合型的情況下，深綠色極顯著低于淡綠色，淺綠色與其他兩者之間無(wú)顯著差異，雜合型的情況下，深綠色極顯著低于淺綠色，淺綠色極顯著低于淡綠色；360 日齡時(shí)，純合型的情況下，深綠色和淺綠色間不存在顯著差異，深綠色和淺綠色均極顯著低于淡綠色，雜合型的情況下，深綠色極顯著低于淺綠色，淺綠色極顯著低于淡綠色；540 日齡時(shí)，純合型的情況下，深綠色極顯著低于淺綠色和淡綠色，淺綠色和淡綠色間不存在顯著性差異，雜合型的情況下，深綠色和淺綠色間不存在顯著差異，均極顯著低于淡綠色。

當(dāng)?shù)皻ゎ伾嗤瑫r(shí)，CHRDL1基因在不同基因型的赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達(dá)情況為：180 日齡、360日齡和540 日齡時(shí)，都表現(xiàn)為在淡綠色蛋殼的情況下，純合型極顯著低于雜合型，其他蛋殼顏色情況下純合型與雜合型間不存在顯著性差異。

表3 CHRDL1 基因在蛋殼腺中的表達(dá)情況

如圖2 所示，CHRDL1基因在不同日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中的表達(dá)量不存在顯著差異。

圖2 不同日齡的赤水烏骨雞蛋殼腺中CHRDL1 基因的差異表達(dá)

2.3.2CHRDL1基因在肝臟中表達(dá)量的情況 由表4 可知，同一產(chǎn)蛋期CHRDL1基因在純合型赤水烏骨雞肝臟中的表達(dá)情況為深綠色極顯著低于淺綠色和淡綠色，180 日齡時(shí)淡綠色與淺綠色間不存在顯著差異；在雜合型赤水烏骨雞肝臟中的表達(dá)情況為深綠色極顯著低于淺綠色和淡綠色，淺綠色極顯著低于淡綠色。

表4 CHRDL1 基因在肝臟中的表達(dá)情況

在蛋殼顏色相同時(shí)，CHRDL1基因在不同基因型的赤水烏骨雞肝臟中的表達(dá)情況為：180 日齡、360 日齡和540 日齡時(shí)，都表現(xiàn)為在淡綠色蛋殼的情況下，純合型中的表達(dá)量極顯著低于雜合型，540 日齡淺綠色情況下，純合型中的表達(dá)量顯著低于雜合型，其他蛋殼顏色情況下不存在顯著性差異。

不同日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1基因的差異表達(dá)情況如圖3 所示，純合型深綠色、純合型淺綠色的條件下，180 日齡和540 日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1基因的表達(dá)量顯著低于360 日齡，純合型淡綠色的情況下，180 日齡和540 日齡極顯著低于180 日齡；雜合型淡綠色的條件下180 日齡和540 日齡顯著低于360 日齡，其余情況下不同日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1基因的表達(dá)量不存在顯著性差異。

圖3 不同日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1 基因的差異表達(dá)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著蛋殼綠色的加深，CHRDL1基因的表達(dá)量降低，與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和相關(guān)分析的結(jié)果一致，認(rèn)為CHRDL1基因可能是影響蛋殼綠色深淺的微效基因。目前對(duì)CHRDL1基因的功能及分子調(diào)控機(jī)制的研究較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHRDL1基因的表達(dá)量與蛋殼綠色深淺存在規(guī)律性，因此推測(cè)CHRDL1基因可能與綠殼蛋的蛋殼色素沉積有關(guān)，將會(huì)對(duì)其進(jìn)一步研究。

相關(guān)研究表明蛋殼膽綠素是在肝臟中合成并由殼腺部分泌的[14]，360 日齡為產(chǎn)蛋的高峰期，此時(shí)肝臟中色素合成的速度加快[15]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，360 日齡的赤水烏骨雞肝臟中CHRDL1基因的表達(dá)量高于180 日齡和540 日齡，因此推測(cè)CHRDL1基因可能與色素的合成有關(guān)。

相關(guān)研究表明蛋殼色素有殼腺部合成和血液中合成2 種途徑[15]，Polin[16]研究發(fā)現(xiàn)子宮組織合成卟啉量為肝組織的2 倍，且不隨組織重量的增加而變化；Li 等[17]采用熒光定量PCR 對(duì)產(chǎn)深淺褐殼蛋母雞肝臟及蛋殼腺的基因表達(dá)量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)卟啉-Ⅸ在蛋殼腺中合成。原卟啉和膽綠素是2 種主要的蛋殼色素[18]。本實(shí)驗(yàn)采集360 日齡赤水烏骨雞的蛋殼腺做了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)CHRDL1基因?yàn)榈皻ぞG色的下調(diào)基因[10]，為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)利用qPCR 技術(shù)檢測(cè)了CHRDL1基因在不同產(chǎn)蛋期的赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中的表達(dá)量，驗(yàn)證了CHRDL1基因?yàn)榈皻ぞG色的下調(diào)基因這一測(cè)序結(jié)果。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CHRDL1基因在赤水烏骨雞肝臟和蛋殼腺中的表達(dá)量表現(xiàn)為雜合子的表達(dá)量高于純合子，在不同基因型都表現(xiàn)為隨蛋殼顏色變深CHRDL1基因的表達(dá)量降低，與本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果顯示CHRDL1基因?yàn)樨?fù)調(diào)控基因相符合，并且與本研究相關(guān)分析結(jié)果顯示的CHRDL1基因表達(dá)量與蛋殼膽綠素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)一致。推測(cè)該基因可能為蛋殼顏色的負(fù)調(diào)控基因，其作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。