陳麗玲 ，鄒田德，賀 琴，郭曉波，盧亞飛，羅波文，王自蕊*，游金明*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江西省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省優(yōu)質(zhì)安全畜禽生產(chǎn)產(chǎn)教融合重點(diǎn)創(chuàng)新中心，江西南昌 330045；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，江西南昌 330004）

腸道既是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場(chǎng)所，也是防御腸道病原菌等有害物質(zhì)入侵的重要屏障。腸道絨毛結(jié)構(gòu)異常和屏障功能損傷是導(dǎo)致斷奶仔豬腹瀉的關(guān)鍵內(nèi)在因素[1]。因此，維持仔豬腸道形態(tài)和正常的屏障功能是促進(jìn)仔豬健康生長(zhǎng)的基本保證。仔豬早期斷奶會(huì)導(dǎo)致小腸絨毛變短、隱窩加深、絨毛高度與隱窩深度之比（V/C）下降，從而降低飼料養(yǎng)分的消化利用率。未消化的養(yǎng)分在腸道堆積后將使腸道內(nèi)滲透壓增加，引發(fā)腹瀉。同時(shí)，后腸段中有害菌和腐敗菌增殖劇增，進(jìn)一步加劇腸絨毛結(jié)構(gòu)與功能的損傷[2]。仔豬小腸上皮細(xì)胞間良好的緊密連接結(jié)構(gòu)是離子和氨基酸類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)選擇性通過(guò)小腸黏膜的前提。仔豬斷奶將下調(diào)腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)量，導(dǎo)致上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)而提高腸道通透性、增加有害微生態(tài)入侵的幾率。Ala-Gln[3]、丁酸梭菌[4]、啤酒酵母提取物[5]、酵母壁多糖[6]等功能性添加劑可以有效改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、提高腸道屏障功能。而在目前飼料中全面禁止使用抗生素的背景下，以中草藥作為替抗產(chǎn)品來(lái)改善仔豬腸道健康的研究逐漸成為熱點(diǎn)。臨床醫(yī)學(xué)上證實(shí)，由白術(shù)茯苓（1:1）配比的中藥復(fù)方可以治療人的腹瀉型腸道疾病，但在仔豬上鮮有報(bào)道。本研究小組在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加0.02%、0.04%、0.06%的白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著提高仔豬的平均日增重，并降低斷奶仔豬的耗料增重比，0.06%白術(shù)茯苓多糖還可有效降低仔豬的腹瀉頻率?；诖?，本研究旨在進(jìn)一步探討白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)仔豬腸道形態(tài)及腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用，以掌握白術(shù)茯苓多糖復(fù)方促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)、改善腸道健康的作用機(jī)制，為指導(dǎo)白術(shù)茯苓多糖復(fù)方在仔豬飼料中的科學(xué)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 白術(shù)多糖（AtractylodesMacrocephalaon Polysaccharide，AMP）和茯苓多糖（Poriacocos polys accharide，PCP）由四川恒瑞通達(dá)生物科技有限公司提供，多糖含量均為37.5%，剩余部分為糊精。白術(shù)多糖和茯苓多糖在使用前按照1:1 預(yù)先混合后待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取150 頭遺傳背景一致、健康狀況良好、體重（7.14±0.22）kg 的23 日齡杜×長(zhǎng)×大斷奶仔豬，按照完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法分為6 組，每組5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 頭豬?？瞻捉M飼喂基礎(chǔ)日糧，抗生素組在基礎(chǔ)日糧中添加硫酸粘桿菌素20 mg/kg+桿菌肽40 mg/kg+喹乙醇100 mg/kg，4 個(gè)試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.02%、0.04%、0.06% 和0.08% 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方?；A(chǔ)飼糧是參考NRC（2012）和我國(guó)《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（2004）配制成的玉米-豆粕型日糧（表1）。試驗(yàn)于2016 年11—12 月在江西省某牧業(yè)有限公司養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期27 d。仔豬飼養(yǎng)于裝有高床、漏縫地板、乳頭式飲水器的保育舍，舍內(nèi)溫度控制為23～25℃、相對(duì)濕度為65%～75%。試驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)豬舍徹底清理、清洗、消毒。試驗(yàn)過(guò)程中，每日飼喂4～5 次。所有仔豬自由采食和飲水，其他飼養(yǎng)管理措施、免疫處理按豬場(chǎng)常規(guī)管理程序進(jìn)行。

1.3 樣品采集及處理 試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取1 頭體重接近平均體重的仔豬，前腔靜脈采集血10 mL 于真空抗凝采血管中。3 000 r/min 離心10 min，分裝后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 腸段樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從每個(gè)重復(fù)中隨機(jī)選取1 頭仔豬，肌注 4%戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉。待麻醉完全后，頸靜脈放血處死，沿腹中線剖開(kāi)腹腔，剪取十二指腸、空腸、回腸中段各3～5 cm。用生理鹽水小心沖洗腸道內(nèi)食糜，而后用干凈濾紙輕輕吸干腸道表面水分。將腸道一端結(jié)扎后，置于4%甲醛溶液中固定24 h 以上，用于制作石蠟切片。

1.3.2 腸道黏膜樣品采集 用無(wú)菌手術(shù)剪剪取空腸和回腸中段各約6 cm。用鑷子輕輕擠出腸道內(nèi)容物，并將冷DEPC 處理水灌入腸腔，小心沖洗腸內(nèi)容物。沿腸段縱軸剪開(kāi)腸壁，經(jīng)干凈濾紙吸水后，用載玻片小心刮取小腸黏膜，分裝于2 mL 無(wú)菌凍存管中，編號(hào)后立即放入液氮中速凍，最后轉(zhuǎn)入-80℃保存，待后續(xù)提取總RNA 和總蛋白。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 腸道通透性 血漿D-乳酸（D-Lactace）、二胺氧化酶（DAO）含量使用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（Thermo，Massachusetts，America）測(cè)定，具體操作按照血漿D-Lactace ELISA 試劑盒（K667-100，美國(guó)BioVision）和DAO ELISA 試劑盒（SBJ-Z051，南京森貝伽生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4.2 腸道形態(tài)結(jié)構(gòu) 取出4% 甲醛溶液固定的腸道組織，經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、H.E.染色后，利用Motic Images Advanced 3.2 軟件，測(cè)量腸道隱窩深度和絨毛高度，每張切片觀察10 個(gè)視野。計(jì)算絨毛高度/隱窩深度（V/C）。

1.4.3 小腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白及相關(guān)基因CDKN1A和p53 表達(dá)水平 根據(jù)GenBank 提供的豬基因序列，用PrimerExpress 5.0 軟件設(shè)計(jì)ZO-1、Occludin、Claudin-1、CDKN1A及p53的基因特異性擴(kuò)增引物。引物序列見(jiàn)表2，引物由上海生物工程有限公司合成。參考肖定福[7]方法提取空腸黏膜總RNA。以GAPDH為內(nèi)參（F：5'-GAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3'、R：5'-CATGGGTAGAATCATACTGGAACA-3'），按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板使用定量PCR（CFX96，美國(guó)伯樂(lè)）進(jìn)行基因擴(kuò)增，以測(cè)定空腸黏膜緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1mRNA以及CDKN1A和p53的相對(duì)表達(dá)量。另取空腸黏膜樣，用裂解液裂解，采用BCA 法測(cè)定總蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)至一致。經(jīng)過(guò)PAGE 分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫下用5% 脫脂奶粉封閉1 h，分別用兔抗Actin（ab8226，Abcam）、兔抗ZO-1（BS-1239R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、Occludin（BS-10011R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、Claudin-1（BS-13739R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）抗體和HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體（ab6789，Abcam）孵育，以通過(guò)Western blot 法檢測(cè)空腸黏膜ZO-1、Occludin 和Claudin-1 蛋白的表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)用Excel2013 簡(jiǎn)單處理后，采用SPSS17.0 軟件中單因素方差分析（One-Way ANOVA）模型進(jìn)行方差分析，Duncan'S 法多重比較，各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。以P＜0.05 為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 如表3 所示，與抗生素組和空白組相比，飼糧中添加白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著增加十二指腸、空腸和回腸絨毛高度，尤其是0.06%組增加最顯著；各組間十二指腸隱窩深度差異不顯著；抗生素組和0.04%、0.06%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組的空腸隱窩深度顯著低于空白組；0.06%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組仔豬十二指腸的V/C 值顯著高于0.02%、0.04%、0.08%白術(shù)茯苓多糖及抗生素組，但0.08% 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組仔豬的空腸、回腸V/C顯著低于抗生素組；0.02%、0.04%、0.06% 白術(shù)茯苓多糖組仔豬十二指腸、空腸、回腸V/C 顯著高于空白組，且隨飼料中白術(shù)茯苓多糖添加量增加，V/C 呈逐漸升高趨勢(shì)，但添加量達(dá)到0.08%時(shí)，十二指腸、空腸、回腸V/C 回落至與空白組無(wú)顯著差異的水平。

2.2 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)斷奶仔豬腸道通透性的影響由表4 可知，與抗生素組和空白組相比，飼糧添加0.02%、0.04%、0.06%、0.08% 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著降低血漿D-Lactate 和DAO 含量，且隨著白術(shù)茯苓多糖復(fù)方添加量的增加呈先降低后回升的趨勢(shì)（P＜0.05）。

2.3 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白基因表達(dá)量的影響 如圖1 所示，與抗生素組和空白組相比，飼糧中添加0.04%、0.06%和0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著增加仔豬空腸黏膜ZO-1和Claudin-1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量；0.04%和0.06%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著增加仔豬空腸黏膜OccludinmRNA 的相對(duì)表達(dá)量。隨著白術(shù)茯苓多糖添加量的增加，ZO-1、OccludinmRNA 的相對(duì)表達(dá)量呈復(fù)方先增加后降低的趨勢(shì)。

如圖2 所示，飼糧中添加白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)空腸黏膜ZO-1、Claudin-1 蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著影響；Occludin 蛋白相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)更為明顯，當(dāng)白術(shù)茯苓多糖復(fù)方添加量達(dá)0.06% 和0.08% 時(shí)，Occludin 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于抗生素組，0.08%白術(shù)茯苓多糖復(fù)方組的Occludin 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于空白組。

2.4 白術(shù)茯苓多糖對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜CDKN1A和p53mRNA 表達(dá)量的影響 由圖3 可知，與抗生素組、空白組相比，飼糧中添加0.04%、0.06%、0.08% 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著提高仔豬空腸黏膜CDKN1AmRNA的相對(duì)表達(dá)量；各組間仔豬空腸黏膜p53mRNA 相對(duì)表達(dá)量則差異不顯著。

表3 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)斷奶仔豬小腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

表4 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)斷奶仔豬腸道通透性的影響

圖1 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白mRNA表達(dá)量的影響

圖2 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)仔豬空腸黏膜緊密連接蛋白的影響

3 討 論

圖3 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方對(duì)仔豬空腸黏膜CDKN1A 和p53 mRNA 表達(dá)量的影響

研究表明，白術(shù)和茯苓多糖對(duì)調(diào)節(jié)動(dòng)物的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)有積極作用，如參苓白術(shù)多糖可緩解雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎大鼠的小腸黏膜絨毛的損傷程度[8]，使大腸桿菌引起的腹瀉小鼠十二指腸絨毛形態(tài)恢復(fù)正常[9]，還能治療小鼠的脾虛泄瀉，使小鼠腸上皮絨毛結(jié)構(gòu)完整、脫落較少，且腸黏膜固有層、間質(zhì)無(wú)明顯水腫[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著增加仔豬小腸絨毛高度，提高V/C；但添加量達(dá)0.08%時(shí)，十二指腸、空腸、回腸V/C 回落至與空白組無(wú)顯著差異的水平。

腸道屏障結(jié)構(gòu)的完整是腸道正常發(fā)揮吸收功能的重要基礎(chǔ)之一。當(dāng)腸道屏障受損時(shí)，腸道的通透性增大[3,11]。臨床上常用參苓白術(shù)散來(lái)治療功能性腹瀉，藥方中人參、白術(shù)、茯苓三者為君藥，功能是補(bǔ)益脾氣、滲濕止瀉，且白術(shù)和茯苓比例是1:1。采用參苓白術(shù)散輔助治療患者的血清DAO 低于西藥常規(guī)治療者[9]。參苓白術(shù)散（藥方中人參、茯苓、白術(shù)為主，且白術(shù)茯苓比例為1:1）中、高劑量組使脾虛泄瀉幼鼠血漿D-Lactate 和DAO 水平顯著降低，說(shuō)明中、高劑量參苓白術(shù)散可降低腸黏膜的通透性，保護(hù)腸黏膜屏障[12]。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，斷奶應(yīng)激常常造成仔豬腸道黏膜屏障損傷，進(jìn)而增加腸道的通透性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加白術(shù)茯苓多糖能顯著降低血漿D-Lactate 和DAO 活性，且隨著白術(shù)茯苓多糖添加量的增加呈先降低后有所回升的趨勢(shì)。仇瑞莉等[9]和黃玉珍[12]的研究也表明，適量的白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能緩解斷奶應(yīng)激對(duì)仔豬腸道黏膜的損傷，降低腸黏膜的通透性。但本研究結(jié)果顯示，白術(shù)茯苓多糖添加量過(guò)大可能會(huì)對(duì)腸黏膜通透性產(chǎn)生不利影響。

腸上皮細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)與腸道物理屏障功能與有密切相關(guān)性，保證腸道有效的緊密連接對(duì)維持腸上皮細(xì)胞極性和防止上皮細(xì)胞間隙中的物質(zhì)溢出都起著重要作用[13-14]。Occludin 蛋白集中在細(xì)胞緊密連接纖維內(nèi)，其完好性關(guān)系著緊密連接的完整性，而ZO-1 蛋白一旦被破壞，細(xì)胞的緊密連接會(huì)隨之發(fā)生改變。劉海萍等[15]認(rèn)為，仔豬早期斷奶會(huì)破壞腸道黏膜結(jié)構(gòu)，增加腸道通透性，可能是由上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin表達(dá)下降所引起。Troeger 等[16]依據(jù)患者十二指腸病樣Claudin-4 和Claudin-7 不表達(dá)，Claudin-2 弱表達(dá)，而Claudin-1 表達(dá)顯著減少，推測(cè)Claudin-1 表達(dá)降低引起緊密連接功能受損，并導(dǎo)致水和離子漏到腸腔內(nèi)，從而引起腹瀉。本研究結(jié)果顯示，飼糧中添加0.04%、0.06% 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著增加仔豬空腸黏膜ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，且隨著白術(shù)茯苓多糖添加量的增加，ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA 相對(duì)表達(dá)量呈先增加后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明白術(shù)茯苓多糖能提高斷奶仔豬空腸黏膜的緊密連接性，從而改善斷奶仔豬腸道健康。但用Western blot 法檢測(cè)空腸黏膜ZO-1、Occludin 和Claudin-1 蛋白表達(dá)時(shí)，結(jié)果顯示ZO-1 和Claudin-1 蛋白表達(dá)各組間差異并不顯著，推測(cè)可能是由于蛋白的表達(dá)與mRNA 的表達(dá)存在時(shí)間差。

腸黏膜受損后，腸上皮細(xì)胞會(huì)參與傷口愈合的過(guò)程，該過(guò)程主要依賴傷口附近區(qū)域上皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化之間的平衡。CDK 抑制因子、細(xì)胞周期蛋白及其依賴性激酶作為細(xì)胞周期調(diào)控因子，發(fā)揮著調(diào)控細(xì)胞周期的作用，而p21/CDKN1A 主要是通過(guò)調(diào)控CDKs 活性參與細(xì)胞周期的調(diào)控；但p21/CDKN1A 是p53 的靶基因，其表達(dá)水平受p53 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與由p53 介導(dǎo)的細(xì)胞DNA 損傷反應(yīng)；當(dāng)細(xì)胞損傷時(shí)，p53啟動(dòng)p21/CDKN1A 的表達(dá)，p21/CDKN1A 抑制cyclin/CDK 活性，使細(xì)胞停滯于Gl 期[17]。p21/CDKN1A 在體內(nèi)外通常被認(rèn)為具有抑制細(xì)胞增殖的作用，而正常野生型p53 活化后可抑制細(xì)胞的增殖、調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、細(xì)胞調(diào)亡等。同時(shí)，p21/CDKN1A 高表達(dá)可阻止細(xì)胞凋亡發(fā)生，這與p21/CDKN1A 能促使細(xì)胞周期阻滯，繼而防止DNA 損傷或促進(jìn)其修復(fù)有關(guān)[18]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與抗生素組、空白組相比，飼糧中添加0.04%、0.06%、0.08% 白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能顯著提高仔豬空腸黏膜CDKN1A 相對(duì)表達(dá)量，各組間仔豬空腸黏膜p53 mRNA 相對(duì)表達(dá)量則差異不顯著，說(shuō)明適量的白術(shù)茯苓多糖復(fù)方可通過(guò)調(diào)控CDKN1A基因的表達(dá)來(lái)抑制空腸上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其修復(fù)，但該調(diào)控途徑可能屬于非p53 依賴型。

4 小 結(jié)

本研究結(jié)果表明，白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能有效改善斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，維持腸道正常的通透性，白術(shù)茯苓多糖的適宜添加量為0.06%；白術(shù)茯苓多糖復(fù)方能改善斷奶仔豬小腸屏障功能，通過(guò)調(diào)控CDKN1A基因的表達(dá)來(lái)抑制空腸上皮細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)空腸黏膜ZO-1、Claudin-1和OccludinmRNA 的表達(dá)。