孫曉江，閆慧詩，張俊蘭，郝瑞榮,2*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西省優(yōu)勢肉用家畜高效安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，山西太谷 030801）

腸道功能影響著動物的健康生長，腸道形態(tài)以及腸道微生物是腸道功能的重要影響因素。大量的體內(nèi)和體外研究表明，正常的腸道菌群是對致病性微生物非常有效的屏障[1]。腸道微生物在腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)[2]、代謝調(diào)控以及控制代謝紊亂[3]等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，而腸道菌群的結(jié)構(gòu)受到宿主基因型、年齡、周圍環(huán)境、食物以及抗生素等多種因素影響[4]。食物作為腸道微生物直接接觸的環(huán)境以及營養(yǎng)來源，對腸道微生物的組成具有重要調(diào)節(jié)作用。近年來，隨著動物福利以及人們對畜產(chǎn)品安全的要求，通過飼料改善畜禽的腸道功能已成為研究熱點。葡萄籽原花青素（Grape Seed Proanthocyanidins，GSPs）是一種天然多酚，因其強(qiáng)大的抗氧化能力和無毒副作用成為備受矚目的飼料添加劑之一[5-6]。原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成，在植物果實中廣泛存在，尤其在肉桂粉、干葡萄籽和高粱麩皮中含量豐富[7]。

目前，已經(jīng)證實GSPs 可以有效地減少仔豬腹瀉，增強(qiáng)免疫力，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，提高抗氧化能力[8-9]。大多數(shù)原花青素可完好無損地到達(dá)結(jié)腸，并被結(jié)腸微生物區(qū)系降解[10]。因此，推測GSPs 可能通過改變結(jié)腸的菌群結(jié)構(gòu)和腸道形態(tài)來改善腸道健康狀態(tài)，而目前這方面研究較少。本試驗旨在研究GSPs 對生長豬結(jié)腸形態(tài)和微生物的影響，為GSPs 的研究和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 葡萄籽原花青素（GSPs）（95% 純度）由天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司提供，含79.28%的低聚原花青素。

1.2 試驗設(shè)計 選取48 頭（60 日齡）平均體重為25.17 kg的杜× 長× 大三元雜交豬。按照單因素完全隨機(jī)設(shè)計分為4 個組。每組3 個重復(fù)，每個重復(fù)4 頭豬。對照組飼喂玉米-豆粕基礎(chǔ)日糧，GSPs 組在基礎(chǔ)日糧中分別添加100、150、200 mg/kg GSPs?；A(chǔ)日糧參照NRC（2012）生長豬營養(yǎng)需要配制，日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。預(yù)試期7 d，試驗期28 d。豬自由采食和飲水。按豬場常規(guī)管理程序進(jìn)行驅(qū)蟲和免疫。

表1 基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分

1.3 生長性能測定 在試驗開始和結(jié)束早上空腹稱重，每天記錄采食量，計算平均日增重、平均日采食量和耗料增重比。

1.4 樣品收集與處理 在第28 天試驗結(jié)束時，每個重復(fù)屠宰1 頭豬，截取結(jié)腸，收集其內(nèi)容物于2.5 mL 已滅菌的凍存管中，迅速置于液氮中，儲存于-80℃冰箱中，用于16S rDNA 高通量測序。再截取2 段結(jié)腸，一段用1%胰蛋白溶液充分清洗，于2.5%戊二醛中固定，4℃保存，用于掃描電鏡觀察。另一段用冰冷生理鹽水沖洗干凈，再放入 4%多聚甲醛中固定，用于光學(xué)顯微鏡下組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.5 腸道菌群測定 腸道內(nèi)容物基因組DNA 提取后，擴(kuò)增16S rDNA 的V3+V4 區(qū)。引物序列為341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'、806R：5'-GGACTA CHVGGGTATCTAAT-3'。后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM 熒光計進(jìn)行定量。將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后等量混合，連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫，于Hiseq2500 PE250 上機(jī)測序。

1.6 腸道組織形態(tài)掃描電鏡觀察和光學(xué)顯微鏡觀察 將固定于2.5%戊二醛中的結(jié)腸樣品經(jīng)過沖洗、脫水、干燥、粘樣、鍍膜等處理后進(jìn)行掃描電鏡觀察。將固定于4% 多聚甲醛中的結(jié)腸經(jīng)過石蠟切片、HE 染色后，通過ImageJ 軟件測量其黏膜厚度。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 測序得到原始數(shù)據(jù)后通過數(shù)據(jù)過濾、Tags 拼接、Tags 過濾、Tags 去嵌合體最終獲得effective tags，以97% 的一致性將序列聚類成為OTUs。之后進(jìn)行OTUs 聚類分析，物種分類分析，Alpha 多樣性分析，Beta 多樣性分析。Bete 多樣性PCoA 的統(tǒng)計分析采用Anosim 分析法，R 值表示組間與組內(nèi)比較的差異程度，一般介于0～1，R＞0 說明組間存在差異，一般R＞0.75 表示大差異，R＞0.5 表示中等差異，R＞0.25 表示小差異，R 等于0 或在0 附近說明組間沒有差異。統(tǒng)計分析的可信度用P值表示，P＜0.05表示統(tǒng)計具有顯著性。Tax4Fun 微生物功能預(yù)測分析，根據(jù)OTU 的物種注釋和豐度信息，使用Tax4Fun 軟件進(jìn)行KEGG 通路的功能注釋，并統(tǒng)計每個KEGG 通路的豐度信息。通過SPSS22.0 軟件采用單因素方差分析（One-Way ANOVO）和鄧肯（Duncan′s）多重比較，結(jié)果以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異顯著。使用 GraphPad Prism 7 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 GSPs 對生長豬生長性能的影響 由表2 可知，在日糧添加GSPs 對生長豬平均日增重、平均日采食量和耗料增重比無顯著影響。

2.2 GSPs 對生長豬結(jié)腸黏膜厚度的影響 由圖1 可知，3 個GSPs 組的結(jié)腸黏膜厚度均較對照組顯著增加，尤其200 mg/kg GSPs 組差異極顯著。

2.3 GSPs 對生長豬結(jié)腸形態(tài)的影響 由圖2 可知，對照組黏膜上皮微絨毛不發(fā)達(dá)，只能在腸腺開口于腸腔處觀測到。100 mg/kg GSPs 組變化較小，但在150 mg/kg GSPs 組和200 mg/kg GSPs 組微絨毛明顯增多并形成類似細(xì)胞衣結(jié)構(gòu)。圖中不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。圖5 同。

表2 日糧添加GSPs 對生長豬生長性能的影響

圖1 GSPs 對生長豬結(jié)腸黏膜厚度的影響

圖2 GSPs 對生長豬結(jié)腸形態(tài)的影響

2.4 結(jié)腸微生物OTUs 和Tags 測序數(shù)據(jù) 由表3 可知，日糧添加GSPs 對生長豬結(jié)腸微生物Total tags（Effective Tags 的數(shù)量）和Taxon tags（有物種注釋的Tags 的數(shù)量）無顯著影響；OTUs 隨著GSPs 添加劑量的增加而顯著降低。

2.3 結(jié)腸微生物Alpha 多樣性指數(shù)統(tǒng)計 chao1 多樣性估算指數(shù)是根據(jù)所測得的 tags 數(shù)和 OTUs 數(shù)量以及相對比例來預(yù)測樣品中微生物的種類，是基于已知結(jié)果所得的相對值。Good’s Coverage 反映樣本的低豐度OTUs 覆蓋情況。Simpson 指數(shù)越接近于 1，則表示該樣品中的物種越豐富。由表4 可知，Good’s Coverage 數(shù)值已高于0.996，表明測序深度已足夠，覆蓋良好。200 mg/kg GSPs 組的chao1 多樣性指數(shù)和Simpson 指數(shù)都較對照組顯著降低。

2.5 結(jié)腸微生物Bete 多樣性PCoA 的統(tǒng)計分析 基于樣本間OTUs 的unweighted Unifrac 分析數(shù)據(jù)結(jié)果，繪制成PCoA 圖形并在圖上顯示Anosim 分析結(jié)果。PCoA主坐標(biāo)分析是一種展示樣本間相似性的分析方式，結(jié)果更集中于體現(xiàn)樣本間的相異性距離，樣品越相似，反映在PCoA 圖中的距離越近。如圖3 所示，150 mg/kg GSPs 組與對照組距離較近，而100 mg/kg GSPs 組和200 mg/kg GSPs 組均距離較遠(yuǎn)，Anosim 分析結(jié)果為R=1（P=0.001）。R 值表示組間與組內(nèi)比較的差異程度，R 值越大，差異越大，說明在結(jié)腸微生物Bete 多樣性組間差異均極顯著高于組內(nèi)差異，表明在生長豬日糧中添加100、150、200 mg/kg GSPs 均改變了結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)。

2.6 GSPs 對生長豬結(jié)腸微生物群落結(jié)構(gòu) 由表5 可知，豬結(jié)腸優(yōu)勢菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）。100、150 mg/kg GSPs 組擬桿菌門的豐度均較對照組顯著升高，而200 mg/kg GSPs 組結(jié)腸擬桿菌門的豐度較對照組顯著降低，而厚壁菌門與之相反。200 mg/kg GSPs 組螺旋菌門（Spirochaetae）豐度均顯著高于對照組。

從圖4 中可以看出，微生物在不同組間菌屬構(gòu)成存在顯著差異。擬桿菌門的普雷沃氏菌科NK3B31 群（Prevotellaceae_NK3B31_group）平均豐度在100 mg/kg（22.02%）和150 mg/kg GSPs（11.57%）組均較對照組（6.03%）顯著升高，在200 mg/kg GSPs（1.20%）組顯著降低?？死锼闺?R-7（Christensenellaceae_R-7_group） 在150 mg/kg GSPs（1.89%） 和200 mg/kg GSPs（19.61%）均較對照組（0.80%）顯著增加。瘤胃菌科 UCG-002（Ruminococcaceae_UCG-002）隨著GSPs 的增加顯著遞增。密螺旋體科-2（Treponema_2）和擬桿菌屬（Bacteroides）在200 mg/kg GSPs（8.90%、2.56%）均較對照組（1.24%、0.80%）顯著上升。乳桿菌屬（Lactobacillus）在3 個試驗組中（1.24%、0.32%、0.03%）均較對照組（9.52%）顯著降低。

表3 日糧添加GSPs 對生長豬結(jié)腸微生物OTUs 和Tags 數(shù)量的影響

表4 日糧添加GSPs 對生長豬結(jié)腸微生物Alpha 多樣性指數(shù)的影響

圖3 結(jié)腸微生物PCoA 分析

表5 日糧添加GSPs 對生長豬結(jié)腸微生物門水平豐度的影響

2.7 結(jié)腸微生物免疫功能Tax4Fun 預(yù)測分析 日糧添加GSPs 生長豬結(jié)腸微生物免疫功能顯著影響的3 條KEGG 通路。由圖5-A 可知，試驗組抗原處理和呈遞（Antigen processing and presentation）均顯著增加。由圖5-B、5-C 可知，200 mg/kg GSPs 組NOD 樣受體信號通路（NOD-like Receptor Signaling Pathway）和FcγR介導(dǎo)吞噬作用（Fc gamma R-mediated Phagocytosis）均顯著下降。

圖4 結(jié)腸物種屬水平分類熱圖

3 討 論

GSPs 是一種黃酮類多酚物質(zhì)，以其超強(qiáng)的抗氧化能力和抗炎癥能力為人們所熟知。課題組前期研究表明，GSPs 可增強(qiáng)豬的抗氧化能力，提高免疫力，降低腹瀉率[8]。同時值得注意的是GSPs 與大分子有機(jī)物結(jié)合成的復(fù)合物在小腸的降解率很低，絕大多數(shù)進(jìn)入結(jié)腸，被結(jié)腸微生物降解[10]。因此，課題組推測GSPs 對于結(jié)腸形態(tài)和微生物具有不容忽視的影響。

圖5 結(jié)腸菌群KEGG 免疫通路的差異分析

通過掃描電鏡可見，隨著生長豬日糧中GSPs 含量的增加，結(jié)腸的腸道形態(tài)有明顯的改變，微絨毛以腸腺為中心向四周擴(kuò)展，并形成類似于細(xì)胞衣結(jié)構(gòu)，有的甚至將腸腺表面覆蓋。尤其在200 mg/kg GSPs 組改變最為明顯，黏膜上皮含有類似于微絨毛細(xì)胞衣以及連接復(fù)合體結(jié)構(gòu)。細(xì)胞衣常見于小腸黏膜表面，形成于吸收細(xì)胞表面微絨毛，其內(nèi)含有雙糖酶、肽酶，促進(jìn)糖類和蛋白質(zhì)的吸收。連接復(fù)合體具有屏障作用，阻止腸腔內(nèi)物質(zhì)進(jìn)入深部組織。而在本研究中出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)是否為細(xì)胞衣以及連接復(fù)合體的功能還有待于進(jìn)一步探究。有研究表明，在體外以400 mg/L 葡萄籽提取物培養(yǎng)腸Caco-2細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于融合時，蛋白質(zhì)含量比對照組細(xì)胞高，刷狀緣更發(fā)達(dá)，微絨毛更高更密[11]。而結(jié)腸黏膜厚度結(jié)果與掃描電鏡觀察結(jié)果一致，3 個GSPs 組黏膜厚度均顯著增加，以200 mg/kg GSPs 組最高。因此，葡萄籽多酚對于改善腸道結(jié)構(gòu)、促進(jìn)腸絨毛增生具有積極作用，其可能的原因是類黃酮與腸道刷狀緣酶之間相互作用的結(jié)果[12]。

原花青素對于細(xì)菌具有抑制作用，而本研究也發(fā)現(xiàn)隨著飼料中GSPs 添加量的增加，OTUs 顯著降低。不同菌屬對不同劑量的GSPs 的適應(yīng)力不同，聚合原花親素被腸道微生物代謝成各種酚酸，包括苯丙酸、苯乙酸和苯戊酸[13]，這些代謝物以及腸道菌群之間的相互競爭都對腸道菌群的生長具有調(diào)節(jié)作用。腸道菌群改變也將會導(dǎo)致腸道功能發(fā)生改變。

普雷沃氏菌屬的成員曾被描述為活性果膠降解體[14]，代謝產(chǎn)生琥珀酸鹽和乙酸鹽。研究證明某些普雷沃氏菌科對難吸收的多糖類具有降解作用[15]，密螺旋體屬通常分布于動物胃腸道中，編碼多種碳水化合物活性酶[16]，同時也是果膠降解菌屬，生成乙酸鹽[17]。而在本研究中，200 mg/kg GSPs 組中普雷沃氏菌科NK3B31 群顯著下降，而密螺旋體科-2 顯著上升，兩者是否存在競爭關(guān)系，有待于進(jìn)一步研究。研究表明，在高飼料轉(zhuǎn)化率的豬回腸中克里斯滕森菌科-R-7 為優(yōu)勢菌屬[18]，其代謝產(chǎn)物有次黃嘌呤、鳥嘌呤、對苯二酚、葡萄糖、瓜氨酸、膽堿和5-羥基吲哚-3-乙酸[19]，還可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs）[20]。本研究中，克里斯滕森菌科-R-7 在200 mg/kg GSPs 組顯著增加。瘤胃菌科成員可以降解宿主不能消化的纖維素和半纖維素產(chǎn)生SCFAs[21]，SCFAs 是上皮和機(jī)體組織的重要營養(yǎng)物質(zhì)[22]，在日糧中添加葡萄籽提取物的雜交母豬糞便中發(fā)現(xiàn)瘤胃菌科顯著增加[23]，這與本研究中瘤胃菌科UCG-002 與GSPs 添加量呈正相關(guān)結(jié)果相一致。乳桿菌屬被GSPs 顯著抑制，這與在小鼠高脂飲食添加GSPs 發(fā)現(xiàn)的趨勢一致[24]。乳桿菌屬通常被當(dāng)作益生菌屬，但乳酸菌科減少可能會減少能量的損失，因為乳酸菌提高了微生物膽汁鹽水解酶的活性，膽汁鹽水解酶的作用主要是水解小腸膽汁鹽和食物共沉淀后的膽固醇，因而削弱了宿主對脂質(zhì)的吸收[25]。擬桿菌屬產(chǎn)生的多糖和丁酸鹽能夠促進(jìn)健康的腸道免疫[26-27]。本研究中，200 mg/kg GSPs 組擬桿菌屬顯著升高。本研究根據(jù)菌群Tax4Fun 功能預(yù)測發(fā)現(xiàn)GSPs 可以提高結(jié)道菌群抗原處理和呈遞能力，添加200 mg/kg GSPs 可以降低NOD 樣受體信號通路和FcγR 介導(dǎo)吞噬作用觸發(fā)的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)GSPs 能夠抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的ERK1/2、JNK 和p38 蛋白的磷酸化抑制MAPK 通路的激活，同時通過抑制IκBα和IKKα的降解抑制NF-κB/p65 的活化[28]，進(jìn)而降低炎癥反應(yīng)，改善細(xì)胞生存環(huán)境。由于當(dāng)時條件有限，本研究中重復(fù)數(shù)較少，每組屠宰了3 頭豬。重復(fù)數(shù)越多，結(jié)果越可靠，之后開展試驗時重復(fù)數(shù)至少要6～8 頭。

4 結(jié) 論

本研究表明，日糧添加GSPs 對生長豬生長性能無顯著影響，200 mg/kg GSPs 可以顯著增加生長豬結(jié)腸黏膜厚度，增加表面微絨毛，顯著降低OTUs，增加克里斯滕森菌科-R-7、瘤胃菌科 UCG-002、擬桿菌屬、密螺旋體科-2 等產(chǎn)生SCFAs 菌群的豐度。