辛京京，李和剛，秦懷遠(yuǎn)，張 寧，趙金山

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）是在生命進(jìn)化的歷程中產(chǎn)生的，它是細(xì)菌和病毒長期競爭的產(chǎn)物。病毒以細(xì)菌為載體，把自己的基因?qū)氲郊?xì)菌當(dāng)中，通過細(xì)菌復(fù)制達(dá)到病毒基因復(fù)制的目的；細(xì)菌為了消除自身染色體上的病毒基因[1-3]，進(jìn)化出獨(dú)特的CRISPR 系統(tǒng)。CRISPR 系統(tǒng)克服了傳統(tǒng)基因編輯打靶效率低、實(shí)驗(yàn)周期長及應(yīng)用范圍窄等缺點(diǎn)，憑借高效、操作簡單等優(yōu)勢在生物學(xué)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用[4-7]，這種簡單的RNA 導(dǎo)向基因編輯技術(shù)已成為生物學(xué)中的革命性工具。

Zetsche 等[8]研究發(fā)現(xiàn)了一種使CRISPR 技術(shù)更簡單、更準(zhǔn)確的方法，即CRISPR/Cpf1 系統(tǒng)。Cpf1 是由一條crRNA 引導(dǎo)的v 型Cas 內(nèi)切核酸酶，它相對于Cas9 具有多方面的優(yōu)勢，包括分子量大小、剪切方式、剪切位置等。Cpf1 擁有廣闊前景，但仍有一些亟需解決的技術(shù)問題，比如依然存在脫靶效應(yīng)[9]，因此可以考慮將Cpf1 蛋白改造成Double nickase（雙切刻酶），以進(jìn)一步降低脫靶效應(yīng)。

Ran 等[10]將Cas9 切刻酶突變體與配對的向?qū)NA 組合以引入靶向的雙鏈斷裂，實(shí)驗(yàn)證明使用成對的單鏈切口可以將細(xì)胞系中的脫靶活性降低50～1 000倍。與此類似，Takashi 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，R1226A（精氨酸突變?yōu)楸彼幔┩蛔凅w產(chǎn)生切刻酶，切割非靶DNA 鏈而不是靶鏈（即只切割單鏈）。另外，由于野生型Cpf1 識別的PAM 為TTTV，此類識別位點(diǎn)比較稀少，如果簡單通過R1226A 的突變來組合雙切刻系統(tǒng)，要找到合適的基因編輯靶位點(diǎn)不太容易；針對這一問題，可以考慮在Cpf1 RR 突變體（識別PAM 為TYCV）[12]基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，適當(dāng)拓展雙切刻系統(tǒng)的靶標(biāo)范圍。本研究以AsCpf1 RR 突變體為基礎(chǔ)進(jìn)行了一些定點(diǎn)突變的改造，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測的方式評價(jià)這些突變體的DNA 靶向切割能力。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 迪慶綿羊皮膚成纖維樣細(xì)胞（DQSHS1）購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，目錄號：KCB90012S；pY010 質(zhì)粒購自Addgene 公司，貨號：69982；SSA-DKK2 報(bào)告載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；BbsI 限制性內(nèi)切酶購自NEB 公司，貨號：R3539S；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自TaKaRa 公司，貨號：AIG1025A；T4 DNA 連接酶購自天根生物公司，貨號：B0202S；DNA膠回收試劑盒購自天根生物公司，貨號：DP209-02；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司，貨號：D6948-01；Lipo3000 脂質(zhì)體購自美國Invitrogen 公司，貨號：L3 000015；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京原平皓生物科技有限公司，貨號：LF103-01；DNA 寡核苷酸由青島擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 載體構(gòu)建

1.2.1 crRNA 通用表達(dá)骨架載體pCpf1-crRNA 的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 設(shè)計(jì)與AsCpf1 匹配的crRNA 的通用表達(dá)骨架載體pCpf1-crRNA（圖1）。

圖1 通用表達(dá)載體質(zhì)粒圖

crRNA 通用表達(dá)載體各元件序列如下：

U6 啟動(dòng)子序列：

轉(zhuǎn)錄起始信號為G，crRNA 上游序列：TAATTTCT ACTCTTGTAGAT，spacer 克隆位點(diǎn)為GGGTCTTCG AGAAGACCTGC，U6 終止子：TTTTTT。

合成上述序列，插入到pUC57 載體的EcoRV 酶切位點(diǎn)，獲得pCpf1-crRNA 載體。此過程委托青島擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.2 靶向crRNA 表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 根據(jù)綿羊DKK2基因的部分基因組DNA 序列（NC_040257.1，21620923...21621362，440 bp）設(shè)計(jì)AsCpf1 的crRNA靶標(biāo)，合成相應(yīng)的DNA 寡核苷酸，其序列信息如表1。

按照表1 所示，與各自crRNA 靶標(biāo)相對應(yīng)的寡核苷酸兩兩退火，反應(yīng)條件：95℃ 5 min，72℃ 10 min，置冰上，獲得14 條雙鏈DNA 寡核苷酸，依次為T1、T2、T3、RRF1、RRF2、RRF3、RRF4、RRF6、RRF9、RRF10、RRR1、RRR3、RRR5、RRR7。

使用Bbs Ⅰ內(nèi)切酶切割Cpf1-crRNA 載體。將所得14 條雙鏈DNA 寡核苷酸分別與切割并純化后的Cpf1-crRNA 載體連接；連接產(chǎn)物進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞（DH5α）轉(zhuǎn)化；涂板，將培養(yǎng)板37℃過夜倒置培養(yǎng)。

挑取單菌落加入到含有1 mL LB（含50 mg/mL 氨芐青霉素）的1.5 mL 離心管中，200 r/min 搖菌7～8 h，進(jìn)行PCR 檢測，使用與各自靶標(biāo)相對應(yīng)的正義鏈寡核苷酸分別與反向引物X2crRNA-R 配對，檢測相應(yīng)單菌落，將獲得120 bp 條帶的陽性菌落送往青島擎科生物技術(shù)有限公司測序驗(yàn)證（測序引物為X2crRNA-R）。

1.3 構(gòu)建突變體 突變體構(gòu)建方案如表2 所示，委托青島擎科生物技術(shù)有限公司在pY010 質(zhì)粒基礎(chǔ)上完成一系列突變實(shí)驗(yàn)。

1.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 選取生長狀態(tài)良好并且傳代代數(shù)在3～5代的迪慶綿羊成纖維細(xì)胞進(jìn)行消化傳代到24 孔板進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞豐富度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。本次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)4 組，均以Cpf1-crRNA 載體作為對照組，其中第一批次實(shí)驗(yàn)是將Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf1-T3（使用量均為0.5 μg）分別單獨(dú)與pY010 質(zhì)粒以及SSADKK2 篩選載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，目的是驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的Cpf1-crRNA 靶標(biāo)是否有效；第二批次實(shí)驗(yàn)首先將Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf1-T3 分別與Cpf1-R1226A 質(zhì)粒以及SSA-DKK2 篩選載體共轉(zhuǎn)染，驗(yàn)證野生型的Cpf1發(fā)生R1226A 的單點(diǎn)突變后，單個(gè)AsCpf1 切口酶的切割活性；然后再將兩對靶標(biāo)組合（Cpf1-T1+Cpf1-T3、Cpf1-T2+Cpf1-T3）分別與Cpf1-R1226A 質(zhì)粒以及SSADKK2 篩選載體共轉(zhuǎn)染，進(jìn)一步驗(yàn)證成對的AsCpf1 切口酶對于雙鏈的切割能力；第三批次實(shí)驗(yàn)是將RRF6、RRF9、RRR5 3 個(gè)靶標(biāo)分別與Cpf1-RRA 質(zhì)粒以及SSADKK2 篩選載體共轉(zhuǎn)染，驗(yàn)證RRA 突變型的Cpf1 能否特異性識別并切割TYCV PAM 靶標(biāo)；第四批次實(shí)驗(yàn)是將Cpf1-RRA 突變體進(jìn)行R1226A 單點(diǎn)突變，將設(shè)計(jì)的7 對靶標(biāo)組合（RRF1+RRR1、RRF2+RRR3、RRF3+RRR3、RRF4+RRR5、RRF6+RRR7、RRF9+RRR7、RRF10+RRR7）分別與Cpf1-RRAA 質(zhì)粒以及SSA-DKK2 篩選載體共轉(zhuǎn)染，驗(yàn)證RRA 突變型的Cpf1 進(jìn)一步發(fā)生R1226A 的單點(diǎn)突變后，對雙鏈切割的能力。轉(zhuǎn)染后，孵育細(xì)胞48 h 后測定雙熒光素酶活性。每一批次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。轉(zhuǎn)染后將數(shù)據(jù)分析結(jié)果記錄于Excel 表格中，使用t 檢驗(yàn)對各組結(jié)果差異顯著性進(jìn)行處理（將實(shí)驗(yàn)組與對照組進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)組之間不做對比）。

表1 DNA 寡核苷酸序列

表2 突變體構(gòu)建

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

1.5.1 細(xì)胞裂解 首先進(jìn)行細(xì)胞洗滌，用移液槍將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基去除，并通過PBS 對細(xì)胞進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)3 次，盡量去除洗滌液。之后，根據(jù)所用細(xì)胞培養(yǎng)板的大小按量加入配置好的細(xì)胞裂解液（CLB），用移液槍充分吹打混勻，使細(xì)胞得到充分裂解，裂解時(shí)間以不超過30 min 為宜。

1.5.2 螢火蟲熒光素酶活性測定 取100 μL LAR（Luciferase Assay Reagent，熒光素酶分析試劑）加入Promega GloMax 20/20 發(fā)光檢測儀測定管底部，加入20 μL 待測樣品，輕輕混勻后，放入儀器中進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.5.3 海腎熒光素酶活性測定 當(dāng)1.5.2 的樣品表達(dá)量檢測出來之后，向樣品中加入與LAR 等量的SR（Stop Reagen，終止試劑），輕輕混勻后，放入儀器進(jìn)行檢測，Stop Reagent 可以立即終止螢火蟲熒光素酶發(fā)光，并且同時(shí)啟動(dòng)海腎熒光素酶發(fā)光反應(yīng)，加入體系與1.5.2 相同。記錄海腎熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度（RLU2）與螢火蟲熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度（RLU1）的數(shù)值，計(jì)算兩組數(shù)據(jù)的比值，即RLU2/RLU1（簡寫為R2/R1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物退火 當(dāng)成對寡核苷酸經(jīng)過退火程序結(jié)合形成雙鏈DNA 序列后，在瓊脂糖凝膠電泳中顯示目的條帶單一且明亮，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)（圖2）。

圖2 靶標(biāo)退火結(jié)果

2.2 酶切 使用BbsI 限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒，將環(huán)形質(zhì)粒切割成鏈狀基因序列，從而與質(zhì)粒在凝膠電泳中產(chǎn)生距離差（圖3），本實(shí)驗(yàn)酶切效果良好，質(zhì)粒被成功切開。

圖3 酶切結(jié)果

2.3 菌液PCR 結(jié)果 菌液PCR 及瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖4 所示，在挑選的15 個(gè)單菌落中，T1-1（1）、T1-2（2）、T1-3（3）、T1-4（4）、T2-1（6）、T2-2（7）、T2-3（8）、T2-4（9）、T2-5（10）、T3-2（12）、T3-3（13）、T3-4（14）、T3-5（15）的PCR 結(jié)果條帶單一明亮，但T1-5（5）、T3-1（11）看不到條帶，因此挑選2、3、8、9、13、14 進(jìn)行質(zhì)粒提取并送往公司進(jìn)行測序。

圖4 菌液PCR 鑒定結(jié)果

2.4 打靶載體和突變體構(gòu)建測序結(jié)果 測序結(jié)果表明（圖5-A），T1-2（2）、T2-3（8）、T3-4（14）目的序列正確的連接到載體上，獲得Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf-T3 載體。其他靶標(biāo)crRNA 表達(dá)載體PCR 結(jié)果類似，本文略去。由圖5-B 可知，4 個(gè)定點(diǎn)突變均設(shè)計(jì)成功。

圖5 打靶載體和突變體構(gòu)建的測序結(jié)果

2.5 雙熒光素酶報(bào)告載體檢測法檢測結(jié)果 通過雙熒光素酶報(bào)告載體檢測法檢測轉(zhuǎn)染結(jié)果，計(jì)算出海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶的比值。每一批次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果均具有較好的可重復(fù)性，故選取其中一次轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果作為代表進(jìn)行作圖展示（圖6）。

圖6 轉(zhuǎn)染效果圖

將Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf1-T3 分別單獨(dú)與pY010質(zhì)粒以及SSA-DKK2 篩選載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染的結(jié)果可以驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的Cpf1-crRNA 靶標(biāo)是有效的（圖7-A）。Cpf1-T1、Cpf1-T2、Cpf1-T3 分別與Cpf1-R1226A 質(zhì)粒以及SSA-DKK2 篩選載體共轉(zhuǎn)染結(jié)果表明（圖7-B），野生型的Cpf1 發(fā)生R1226A 的單點(diǎn)突變后，單個(gè)AsCpf1切口酶在3 個(gè)TTTV PAM 靶位點(diǎn)中的2 個(gè)靶位點(diǎn)具有顯著的切割活性，說明其切割DNA 雙鏈的能力并沒有完全喪失；2 對靶標(biāo)組合（Cpf1-T1+Cpf1-T3、Cpf1-T2+Cpf1-T3）分別與Cpf1-R1226A 質(zhì)粒以及SSA-DKK2 篩選載體共轉(zhuǎn)染結(jié)果表明（圖7-C），2 條靶位點(diǎn)相距100 bp以上的crRNA 可以誘導(dǎo)AsCpf1 切口酶造成實(shí)質(zhì)上的雙鏈斷裂；RRF6、RRF9、RRR5 3 個(gè)靶標(biāo)分別與Cpf1-RRA 質(zhì)粒以及SSA-DKK2 篩選載體共轉(zhuǎn)染結(jié)果表明（圖7-D），RRA 突變型的Cpf1 可以特異性識別并切割TYCV PAM 靶標(biāo)；Cpf1-RRA 突變體進(jìn)行R1226A單點(diǎn)突變之后，將設(shè)計(jì)的7 對靶標(biāo)組合（RRF1+RRR1、RRF2+RRR3、RRF3+RRR3、RRF4+RRR5、RRF6+RRR7、RRF9+RRR7、RRF10+RRR7） 分別與Cpf1-RRAA 質(zhì)粒以及SSA-DKK2 篩選載體共轉(zhuǎn)染，結(jié)果表明（圖7-E），RRA 突變型的Cpf1 進(jìn)一步發(fā)生R1226A 的單點(diǎn)突變后，不僅喪失了切割雙鏈的功能，連預(yù)計(jì)的單鏈切刻的活性都沒有了，但是仍有可能具有識別并結(jié)合特定靶標(biāo)的能力。

圖7 雙熒光素酶報(bào)告載體檢測法檢測結(jié)果

3 討 論

Gao 等[12]使用基于結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的靶向誘變技術(shù)設(shè)計(jì)出2 種AsCpf1 和LbCpf1 突變體RVR (S542R/K548V N552R)和RR(S542R/K607R)，它們分別可以有效識別5'-TATV-3'PAM 序列和5'-TYCV-3'PAM 序列，增加了Cpf1 的靶向范圍。研究證明，設(shè)計(jì)FnCpf1 和MbCpf1的RR 突變體并將它們與AsCpf1 和LbCpf1 突變體進(jìn)行比較，最終能夠在保留對TTTV PAM 靶標(biāo)活性的基礎(chǔ)上，特異性地識別TYCV PAM 靶標(biāo)，同樣擴(kuò)展了靶標(biāo)范圍[13]；Kleinstiver[14]等通過人類細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，與大多數(shù)Cpf1 直向同源物相比，enAsCpf1 變體靶向范圍大約提高了7 倍，同時(shí)還具有優(yōu)異的靶向活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RRA 突變型的AsCpf1 可以特異性識別并切割TYCV PAM 靶標(biāo)，擴(kuò)展了靶標(biāo)范圍，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道相符[12]。

研究證明，成對的切口能夠在細(xì)胞系中將脫靶活性降低50～1 000 倍，并促進(jìn)小鼠受精卵中的基因敲除而不影響靶向切割效率[10]；當(dāng)距離相近的一對sgRNA同時(shí)識別并結(jié)合目的基因的特定區(qū)域后，Cas9n 酶通過2 個(gè)相鄰的單鏈切口實(shí)現(xiàn)DNA 雙鏈的斷裂[15]；本研究將野生型的Cpf1 進(jìn)行“改造”（R1226A 的單點(diǎn)突變）后，其切割DNA 雙鏈的能力并沒有完全喪失，它是否能對染色體上內(nèi)源性基因靶位點(diǎn)展開有效的DNA雙鏈切割還有待驗(yàn)證；雖然2 個(gè)靶位點(diǎn)相距100 bp 以上的crRNA 可以誘導(dǎo)AsCpf1 切口酶造成實(shí)質(zhì)上的雙鏈斷裂，但是成對的crRNA 能否起到有效的協(xié)同作用還需要通過內(nèi)源性基因敲除效率檢測實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。就目前結(jié)果來看，成對的AsCpf1 切口酶造成的雙鏈DNA 切割效率較低，尤其是當(dāng)它發(fā)生RRA 突變之后，甚至不能產(chǎn)生DNA 單鏈切口。因此可以考慮將LbCpf1 或者其他直系同源物用來進(jìn)行雙切刻系統(tǒng)的研究與改良。有研究證明，HkCpf1 可以識別更為寬泛的PAM 序列（5'-YTN 和5'-TYYN），進(jìn)一步提高基因組靶標(biāo)的識別范圍[16]，理論上更適合用來做雙切刻系統(tǒng)。Kleinstiver 等[14]構(gòu)建了enCpf1、enRR 等突變體，尤其是enCpf1 突變體將Cpf1-BE3 的堿基編輯效率由接近于0 提高到2%～34%，由此推測en 突變（E174R/S542R/K548R）有可能恢復(fù)AsCpf1 RR 突變體的單鏈切刻活性。

本實(shí)驗(yàn)篩選陽性單克隆使用的方法是菌落PCR，以單個(gè)菌落作為模板可以快速鑒定菌落是否為含有目的基因的陽性菌落，操作簡便，靈敏度高，是有別于酶切驗(yàn)證的高效方法；缺點(diǎn)是成本相對較高，需額外構(gòu)建報(bào)告載體。本實(shí)驗(yàn)中報(bào)告載體SSA-DKK2 利用率較高，應(yīng)用效果穩(wěn)定，凸顯出本方法在初步驗(yàn)證基因編輯工具有效性實(shí)驗(yàn)中的特殊優(yōu)勢。另外，目前某些向?qū)NA表達(dá)載體的構(gòu)建指南推薦使用單菌落直接測序的方式來鑒定陽性克隆[17]，其主要邏輯是認(rèn)為載體連接的效率很高，簡單挑取幾個(gè)單菌落就可以鑒定到陽性菌落。但是通過本實(shí)驗(yàn)室長期實(shí)踐表明，在某些特定條件下，單菌落的陽性率并不高，甚至達(dá)不到10%。如果僅僅依靠測序來篩選，測序費(fèi)用會(huì)比較高，而且影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度；而使用PCR 檢測的方式就可以進(jìn)行較大范圍篩選[18]，減少測序費(fèi)用，加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。

本實(shí)驗(yàn)的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對轉(zhuǎn)染結(jié)果進(jìn)行檢測，檢測方便、快速，靈敏度高[19]，不受細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)的影響。不同的crRNA 靶標(biāo)切割效率差異較大，在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中通過T7E1 和Surveyor 核酸酶測定等方法鑒定高效靶標(biāo)，比較耗費(fèi)時(shí)間和精力。此外，對于T7E1 測定或Surveyor 核酸酶測定中的PCR 擴(kuò)增，由于缺乏合適的引物對，有時(shí)難以特異性擴(kuò)增基因組DNA 中的目的序列，對于基因組中具有高多態(tài)性的生物，還可能出現(xiàn)假陽性的結(jié)果[20]；相反，雙熒光素酶報(bào)告基因測定不依賴于基因組擴(kuò)增程序。

4 結(jié) 論

本研究證明，針對TTTV PAM 的CRISPR/AsCpf1雙切刻系統(tǒng)有DNA 雙鏈切割活性，但是單個(gè)的AsCpf1切口酶的DNA 雙鏈切割活性并未完全喪失；AsCpf1-RRA 突變體針對TYCV PAM 靶標(biāo)具有一定的DNA 雙鏈切割活性；AsCpf1-RRAA 突變體沒有檢測到針對TYCV PAM 靶標(biāo)的DNA 雙鏈和單鏈切割活性，但可能保留了DNA 結(jié)合能力。