郭振清，李紅強(qiáng)，孫 健

（河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，河北昌黎 066600）

白色脂肪組織主要以儲存能量為主，而棕色脂肪主要以消耗能量和產(chǎn)生熱量為主[1]。研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織形成的起始階段、分化階段和成熟階段受到各種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，其中PPAR 家族蛋白在各階段發(fā)揮重要作用[2]。PPAR 家族屬于配體激活類轉(zhuǎn)錄因子，可被細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸和脂肪酸代謝物等多種配體激活[3-4]，PPAR 蛋白與靶基因啟動子的特異靶向元件序列結(jié)合，隨后與類維生素A 受體形成異源二聚體驅(qū)動生理或病理?xiàng)l件下基因的表達(dá)[5-6]。PPAR 家族蛋白調(diào)控特異性靶基因的表達(dá)[7]，參與脂代謝、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、肥胖、癌癥、炎癥和動脈粥樣硬化等生物學(xué)過程[8-9]，該家族有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ3 個(gè)成員，其在不同的組織中表達(dá)。PPARα主要在脂肪酸氧化率較高的組織中表達(dá)，如肝臟、心臟、肌肉和棕色脂肪組織等[10]，參與游離脂肪酸激活和延伸及去飽和、甘油三酯及脂滴的合成與分解、載脂蛋白代謝、糖異生和膽汁酸代謝等多種生物學(xué)過程。PPARβ/δ主要在肌肉中高表達(dá)，其次為脂肪組織和皮膚。PPARγ主要在脂肪組織中高表達(dá)[11-12]，在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)生成和代謝方面具有十分重要的作用，其在炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用[2]。

目前對于該家族的研究主要集中在小鼠[13-14]，而以豬為對象的研究較少。豬肉品質(zhì)（多汁性、風(fēng)味、柔軟程度）與脂肪沉積緊密相關(guān)[15]，如何改善脂肪沉積一直是育種工作者的重要目標(biāo)。本研究通過構(gòu)建長白豬PPARα、PPARγ真核表達(dá)載體并對其進(jìn)行生物信息學(xué)和組織表達(dá)規(guī)律分析，為進(jìn)一步揭示PPARs在豬中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)選擇6 月齡去勢長白公豬，來自河北省秦皇島市昌黎縣肉聯(lián)廠，采集長白豬新鮮心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腿肌、頸闊肌、肱二頭肌、皮下脂肪、胃、小腸和空腸12 種組織樣品，樣品采集后迅速置于液氮中，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用，所有樣品均在-80℃低溫保存。

1.2 主要試劑 Trizol、PCR 相關(guān)試劑、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T Vector、感受態(tài)細(xì)胞DH5α和DL2000 DNA Ladder 購自北京索萊寶生物科技有限公司；普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒（美國Omega 公司）；DEPC、Goldenview 型核酸染色劑購自北京拜爾迪生物科技有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；普通PCR 儀（ABI17500，美國ABI 公司）；定量PCR 儀（賽默飛世爾，美國）；電泳儀（DYY-4C 型，北京市六一儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)和合成 參考GenBank 數(shù)據(jù)庫中豬PPARα（登錄號：NM_001044526），PPARγ（登錄號：NM_214379.1）序列，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物[16]（表1）并由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.3.2 總RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄 取適量組織加入到預(yù)冷的2 mL EP 管中，隨后加入1 mL 的Trizol 試劑，使用組織破碎儀（70.0 HZ，20 s）連續(xù)破碎5 次后加入200 mL氯仿，隨后12 000 r/min 低溫離心15 min；將上層液體移至新EP 管中并加等體積異丙醇，混勻后放置10 min，12 000 r/min 低溫離心15 min；將上層液體棄去留下底部沉淀，加入1 mL 75%乙醇，重復(fù)該過程，最后加20 μL DEPC 水溶解總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法參照試劑盒說明書。

1.3.3 基因擴(kuò)增 以cDNA 為模板，利用上述引物（表1）通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增長白豬PPARα、PPARγ基因。PCR反應(yīng)總體系為10 μL：5 μL 2×Taq Master Mix、100 ng/μL模板1 μL、上下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL、3 μL H2O。PCR 擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min；20℃，5 min。將PCR 回收產(chǎn)物與pMD18-T 載體連接，連接體系為10 μL：目的片段6 μL，載體2 μL，Buffer 1 μL 和pMD18-T 連接酶1 μL，16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌株并進(jìn)行PCR 鑒定。以上述重組載體為模板利用PCR 技術(shù)克隆基因CDS 序列，與pcDNA3.1 載體相連，隨后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，最后挑取單菌落并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 采用表2 中的各種工具對長白豬PPARα、PPARγ對應(yīng)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。PPARα、PPARγ物種類型分別為人（Homo sapien）、獼猴（Macaca mulatta）、小鼠（Mus musculus）、豬（Sus scrofa）、牛（Bos tauru）、山羊（Capra hircu）、綠頭鴨（Anas platyrhynchos）、雞（Gallus gallus）。

1.3.5 基因組織表達(dá)分析 以12 種組織的cDNA 為模板，使用定量PCR 引物序列（表1），參照TAKARA SYBR?Premix Ex TaqTMII 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR 檢測基因在各組織中的表達(dá)量。PCR 反應(yīng)體系20 μL：SYBRqPCR Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物（10 pmol/L）各0.4 μL，ROX Reference Dye2 0.4 μL，去離子水6.8 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min；循環(huán)反應(yīng)，95℃10 s，60℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用GAPDH為內(nèi)參校正個(gè)體間差異，利用2-△△Ct方法計(jì)算長白豬PPARα和PPARγ在各組織中的相對表達(dá)量，并使用GraphPad Prism5 軟件[19]將表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析。

表1 PCR 引物序列信息

表2 生物信息學(xué)軟件[17-18]

2 結(jié)果

2.1 長白豬PPARα、PPARγ基因的擴(kuò)增 由圖1-A 可知，與DNA Ladder Marker 相比，1、2 泳道條帶均處于1 000～2 000 bp，PPARα序列長度為1 407 bp，PPARγ序列長度為1 515 bp，擴(kuò)增片段大小與理論產(chǎn)物一致。將擴(kuò)增產(chǎn)物與載體連接并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落并提取質(zhì)粒，使用PCR 技術(shù)檢測質(zhì)粒并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1-B），發(fā)現(xiàn)構(gòu)建好的載體大小于預(yù)期相符合，經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司測序獲得核苷酸序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫公布的序列一致。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 分析長白豬PPARα基本理化性質(zhì)顯示，編碼468 個(gè)氨基酸，其分子量為52.17 ku，理論等電點(diǎn)為5.77，含有亮氨酸（Leu）個(gè)數(shù)為49，比例最高，為10.5%，而色氨酸（Trp）個(gè)數(shù)為1，比例最低，為0.2%，其分子式為C2308H3654N618O695S31，總原子數(shù)目為7306。PPARγ編碼504 個(gè)氨基酸，分子量為57.51 ku，理論等電點(diǎn)為5.60，其中亮氨酸（Leu）比例最高，為10.5%，而色氨酸（Trp）比例最低，為0.2%，含有負(fù)電荷氨基酸殘基的數(shù)目為71，含有正電荷的氨基酸殘基數(shù)目為58，其分子式為C2575H4046N670O766S27，總原子數(shù)量為8 084。

2.2.2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 長白豬PPARα二級結(jié)果分析顯示，α螺旋、無規(guī)卷曲、伸展鏈和β轉(zhuǎn)角分別占48.93%、35.90%、10.68%和4.49%。長白豬PPARγ二級結(jié)構(gòu)分析顯示，α螺旋、無規(guī)卷曲、伸展鏈和β轉(zhuǎn)角分別占比為46.63%、34.92%、12.30%和6.15%。該結(jié)果顯示這2 種蛋白α螺旋和無規(guī)卷曲是其主要結(jié)構(gòu)。

圖1 長白豬PPARα 和PPARγ 基因的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2.3 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域和疏水性預(yù)測 跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，PPARα蛋白不含有TMHs，同樣PPARγ預(yù)測發(fā)現(xiàn)其TMHs 數(shù)量為0，推測這2 種蛋白均不含有跨膜結(jié)構(gòu)域。親疏水性算法認(rèn)為大于0.5 的區(qū)域?yàn)槭杷畢^(qū)，小于-0.5 的區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)，在-0.5～0.5 的區(qū)域?yàn)閮捎H區(qū)域。結(jié)果顯示長白豬PPARα親疏水性的最小值為-3.078，最大值為2.933，親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域，因此推測該蛋白為親水性蛋白。長白豬PPARγ親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，最小值為-2.789，最大值為3.6，親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域，因此推測該蛋白為親水性蛋白。

2.2.4 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測 磷酸化位點(diǎn)通常在蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）和賴氨酸（Tyr）3 個(gè)氨基酸殘基上。預(yù)測結(jié)果顯示，長白豬PPARα共有45 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中蘇氨酸殘基上有15 個(gè)，分別位于4、52、71、82、129、190、200、253、279、283、285、288、307、438、450 氨基酸殘基；絲氨酸殘基上有25個(gè)，分別位于6、12、21、24、38、40、45、46、48、50、59、63、66、73、76、77、80、93、110、142、163、179、205、293、346 氨基酸殘基；賴氨酸殘基上有5 個(gè)，分別位于54、83、314、464、468 氨基酸殘基。同樣方法預(yù)測到50 個(gè)PPARγ磷酸化位點(diǎn)，其中蘇氨酸殘基上有14 個(gè)，分別位于 4、19、29、33、40、65、74、165、256、265、268、269、324、343 氨基酸殘基；絲氨酸殘基上有27 個(gè)，分別位于 8、14、25、45、50、56、58、70、71、103、111、116、185、225、226、235、248、252、272、281、359、369、382、409、421、456、491 氨基酸殘基；賴氨酸殘基上有9個(gè)，分別位于77、101、115、150、249、326、354、500、504 氨基酸殘基。糖基化位點(diǎn)修飾分為兩種，即O 端和N 端糖基化位點(diǎn)，利用在線軟件NetOGlyc3.1和NetNGlyc1.0 分析O 端和N 端糖基化位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，長白豬PPARα共有14 個(gè)O 端糖基化位點(diǎn)，分別位于4、63、69、71、73、76、80、82、93、95、196、179、234 氨基酸殘基，沒有檢測到N 端糖基化位點(diǎn)，長白豬PPARγ共有18 個(gè)O 端糖基化位點(diǎn)分別位于14、19、25、29、71、103、111、116、119、130、203、235、248、265、268、269、272 和295 氨基酸殘基，檢測到23 位氨基酸殘基處有1 個(gè)N 端糖基化位點(diǎn)。

2.2.5 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 對長白豬的PPARα、PPARγ編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模（圖2），可以看出2種蛋白的三級結(jié)構(gòu)總體十分相似，但2 種蛋白的氨基酸總數(shù)存在區(qū)別，在三級結(jié)構(gòu)也存在不同，文中用紅色標(biāo)記出兩者的不同。從三級結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)2 種蛋白α螺旋和無規(guī)卷曲占比例較高，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果一致。PPARα在99～173 位氨基酸殘基為DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，PPARγ的135～209 位氨基酸殘基為DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，兩者該結(jié)構(gòu)域相似性82.67%。PPARα在239～466 位氨基酸殘基為配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，PPARγ的237～502 位氨基酸殘基為配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，兩者該結(jié)構(gòu)域相似性64.04%。

圖2 長白豬PPARα 和PPARγ 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.6 長白豬與其他物種系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 對8 個(gè)物種的PPARα、PPARγ蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖3-A 顯示，豬的PPARα蛋白質(zhì)氨基酸序列與牛和山羊的親緣關(guān)系較近，其次為小鼠和人，與綠頭鴨和雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，山羊、牛和豬同屬于偶蹄目，由此說明該蛋白在進(jìn)化過程中較為保守。PPARγ蛋白質(zhì)氨基酸序列的親緣關(guān)系與PPARα不同，豬的該蛋白與人、獼猴和小鼠的親緣關(guān)系較近，與山羊和牛的親緣關(guān)系次之，與綠頭鴨和雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖3-B），由于該蛋白的氨基酸序列在跨越不同的目和科，在保守性方面較PPARα差。

圖3 長白豬PPARα 和PPARγ 與其他物種氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

將豬PPARα序列與其他各物種序列比較發(fā)現(xiàn)（圖4），豬與牛的同源性最高，為94.9%，其次為山羊94.7%，與進(jìn)化樹關(guān)系所得結(jié)果一致。將豬PPARγ序列與其他各物種序列比較發(fā)現(xiàn)（圖5），豬與人的同源性最高，為98.5%，其次為獼猴和小鼠，分別為98.2%、98.1%，與進(jìn)化樹關(guān)系所得結(jié)果一致。

2.3 長白豬PPARα、PPARγ基因的組織表達(dá)譜 如圖6-A所示，PPARα在長白豬的肝臟中表達(dá)量最高，其次為腎臟、脂肪組織和胃，脾臟的表達(dá)量最低，該基因在這些組織的表達(dá)量較其他組織均達(dá)到差異極顯著水平；其他各組織均有表達(dá)。由圖6-B 可知，PPARγ在長白豬的脂肪組織中表達(dá)量最高，胃中表達(dá)量次之，該基因在這2種組織中表達(dá)量與其他組織達(dá)到極顯著差異水平；其他各組織表達(dá)量較低且種間未達(dá)到差異極顯著水平。

圖4 不同物種PPARα 序列差別（下三角）和相似性（上三角）

圖5 不同物種PPARγ 序列差別 (下三角) 和相似性 (上三角)

圖6 長白豬PPARα 和PPARγ 基因在各組織中的表達(dá)量

3 討 論

本研究成功克隆了長白豬的PPARα、PPARγ基因，測序PPARα基因CDS 區(qū)全長為1 407 bp，編碼468 個(gè)氨基酸；PPARγ基因CDS 區(qū)全長1 515 bp，編碼504個(gè)氨基酸，克隆得到的序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的豬PPARα、PPARγ序列一致。通過親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)PPARα、PPARγ的保守性都很強(qiáng)，該結(jié)果與在廣西巴馬小型豬中研究結(jié)論一致[20]。目前對不同品種豬中這2種基因有效遺傳變異位點(diǎn)的研究尚未報(bào)道，在后續(xù)的研究中通過擴(kuò)大樣品量篩選有效的遺傳標(biāo)記，為豬育種工作提供依據(jù)。

對兩基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析的結(jié)果顯示，長白豬PPARα、PPARγ2 種蛋白二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)卷曲為主，與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。這2 種蛋白均不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，為親水性蛋白，該預(yù)測結(jié)果與2 種蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控特異性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)相符合，因?yàn)樗鼈儼l(fā)揮功能時(shí)首先轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，而非與膜結(jié)構(gòu)相結(jié)，同時(shí)對其保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，長白豬PPARα、PPARγ均由DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，且同源性較高。PPAR 屬于核受體家族成員，其活性受到多種翻譯后修飾，包括磷酸化、糖基化、泛素化和類泛素化等多種形式[21-22]。本研究在蛋白質(zhì)翻譯后修飾預(yù)測中也發(fā)現(xiàn)2 種蛋白含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和一些糖基化位點(diǎn)。

本研究采集了長白豬12 個(gè)不同部位的組織樣品，通過qT-PCR 技術(shù)檢測PPARα、PPARγ的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)PPARα基因在肝臟中高表達(dá)。饒遼源等[23]研究證明PPARα主要在山羊的腎臟和肝臟中表達(dá)較高。另有報(bào)道PPARα在不同品種豬、不同周齡豬的肝臟組織表達(dá)水平存在差異[21]，提示該基因存在物種差異和時(shí)序性。本研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ基因在脂肪組織中表達(dá)量最高，這與江口蘿卜豬、從江香豬和八眉豬各組織中PPARγ基因表達(dá)量的結(jié)果一致[24-25]，且隨著喂養(yǎng)月齡的不同呈上升趨勢，但廣西巴馬小型豬發(fā)現(xiàn)PPARγ基因在大腸組織中表達(dá)量最高[20]，該結(jié)果表明PPARγ基因在不同的豬品種之間存在表達(dá)差異，可能與廣西小型豬特殊的形體有關(guān)。另外，在不同冷刺激下PPARγ基因表達(dá)量也有不同[26]，提示該基因能量平衡方面具有重要作用。同時(shí)，張青青等[27]在黃牛中的研究結(jié)果也顯示，在脂肪組織分化的不同時(shí)間點(diǎn)PPARγ基因的表達(dá)量不同，這些數(shù)據(jù)說明該基因在脂肪組織中具有重要功能。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了長白豬PPARα和PPARγ的CDS序列，其核苷酸序列長度分別為1 407 bp 和1 515 bp，隨后構(gòu)建了真核表達(dá)載體；2 種蛋白主要二級結(jié)構(gòu)為α螺旋和無規(guī)卷曲，為親水蛋白且保守性較強(qiáng)；PPARα在長白豬的肝臟中表達(dá)量最高，脾臟的表達(dá)量最低，PPARγ在長白豬的脂肪組織中表達(dá)量最高，胃中表達(dá)量次之，提示2 種基因在機(jī)體能量代謝方面發(fā)揮作用。