平秋婷

(廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣州 510316)

亞硝酸鈉俗稱亞硝酸鹽，是一種由亞硝酸根離子與鈉離子合成的無機鹽，主要應(yīng)用于食品中，具有護色劑功能，保障食物的顏色鮮艷，雖然這種食品添加劑具有一定的優(yōu)點，但是其與食品共同進(jìn)入人體會與人體中的蛋白質(zhì)等有機物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)生成致癌物質(zhì)，甚至?xí)⑷梭w內(nèi)的正常血紅蛋白氧化為缺乏輸氧功能的高鐵血紅蛋白，為食品消費者帶來巨大的安全隱患。為此，如何快速、精準(zhǔn)地測定食品中亞硝酸鈉含量已經(jīng)成為人們的重要研究課題。

文獻(xiàn)[1]中采用色譜法對食品中的亞硝酸鈉含量進(jìn)行測定，對食品中的亞硝酸鹽類物質(zhì)進(jìn)行離子色譜、氣相色譜和高效液相色譜法的含量測定；文獻(xiàn)[2]中應(yīng)用電化學(xué)分析法，將食品物質(zhì)溶入到液體化學(xué)電池中，通過判斷電解池中的電位差或電流強度來判定食品中亞硝酸鈉含量。

本文主要研究應(yīng)用改良法分光光度計測定食物中的亞硝酸鈉含量，并依據(jù)GB 5009.33-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中第二法分光光度法(鹽酸萘乙二胺法)整理本文方法下的相關(guān)實驗數(shù)據(jù)，驗證本文方法的快速有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

分光光度計、電子天平、量筒、燒杯、玻璃棒、漏斗、擦鏡紙、肉類食品、酒精燈、溫度計、氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘乙二胺溶液、重鉻酸鉀、橘紅G、硫酸、蒸餾水、重氮鹽等。

1.2 方法

本文應(yīng)用肉類食品作為測定方法的樣品，將肉類食品進(jìn)行蛋白質(zhì)剔除與脂肪剔除，在酸性環(huán)境中投入亞硝酸鈉，亞硝酸鈉與酸性環(huán)境中物質(zhì)融合后再次向酸性環(huán)境中加入重氮鹽與鹽酸萘乙二胺，生成一種能夠被分光光度計識別的623 mm波長的可吸收光波[3-4]。

方法的實現(xiàn)過程：

(1)需要將肉類食品打磨成肉泥狀物質(zhì)，利用電子天平精準(zhǔn)提取10 g樣品；

(2)再將樣品置于50 mL的燒杯中，用玻璃棒持續(xù)攪拌2 min左右，向燒杯內(nèi)加入飽和狀態(tài)下的蒸餾水；

(3)再次用玻璃棒攪拌2 min左右，應(yīng)用酒精燈對燒杯進(jìn)行加熱，當(dāng)燒杯中樣品溫度達(dá)到80 ℃停止加熱，將燒杯中樣品轉(zhuǎn)入量筒中并進(jìn)行搖勻；

(4)再次將量筒中的樣品進(jìn)行水浴加熱至70 ℃，最后用冷水浴的方式使樣品溫度降低到常溫，獲取肉類食品的待測定食品提取液。

由于只經(jīng)過加熱處理后的待測定樣品中會存在一些易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的其他有機物質(zhì)，所以本文將在常溫化的樣品提取液中加入3 mL亞鐵氰化鉀溶液，再加入50 mL蒸餾水進(jìn)行樣品定容并搖勻，使樣品提取液靜置止1 h，容易產(chǎn)生化學(xué)變化或干擾分光光度計進(jìn)行測定的物質(zhì)沉淀在量筒底部，溶液上層澄清的液體主要為蒸餾水以及其他濾液，不包含本次實驗測定的亞硝酸鈉物質(zhì)與肉類食品含量，樣品提取與凈化流程圖見圖1。

圖1 樣品提取與凈化流程圖Fig.1 The flow chart of sample extraction and purification

實驗中還制定亞硝酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用電子天平精準(zhǔn)量取0.2 g亞硝酸鈉，在干燥常溫的環(huán)境中制取亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，為了防止亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液在空氣中氧化而干擾分光光度計對亞硝酸鈉的測定結(jié)果，需要在實驗進(jìn)行過程中對亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行現(xiàn)用現(xiàn)配[5-6]。將配制好的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液放置在經(jīng)過改良法改良后的分光光度計比色管中，并在比色管中添加一定量的氨基苯磺酸溶液，待比色管中溶液靜置10 min左右，管內(nèi)會產(chǎn)生少量的重氮鹽，為了防止重氮鹽對亞硝酸鈉含量的干擾，再向比色管中添加鹽酸萘乙二胺溶液定容，分解比色管中的重氮鹽，此時比色管中需要具體加入的相關(guān)溶劑見表1。

表1比色管中需要具體加入的相關(guān)溶劑量Table 1 The specific solvent amount added into the colorimetric tube mL

(1)應(yīng)用分光光度計吸取比色管中的樣品溶液與亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，并分別將不同濃度的樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液放置于50 mL容量的量筒中；

(2)再分別向每個量筒中加入2 mL氨基苯磺酸試劑，與樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液完全混合，靜置5～6 min后再向各個量筒中加入鹽酸萘乙二胺溶液；

(3)將量筒內(nèi)的溶液搖勻，再靜置5 min左右，用比色杯對不同濃度的樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行不同波長的測定吸取，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線在分光光度計中體現(xiàn)。

不同濃度下的分光光度計曲線測定圖見圖2。

圖2 不同濃度下的分光光度計曲線測定圖

1.3 改良法分光光度計性能測試

本文應(yīng)用改良法的分光光度計對食品中亞硝酸鈉含量進(jìn)行測定，具有一定的自動化性能，相對于普通的分光光度計更加智能化，在實驗測定前需要對改良法分光光度計進(jìn)行性能測定，確定分光光度計對亞硝酸鈉的波長識別能力、雜光識別能力、散光吸收能力有著良好的穩(wěn)定性[7-9]。

根據(jù)國家市場監(jiān)督管理總局對分光光度計相關(guān)儀器的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，儀器設(shè)備對雜散光的吸收精準(zhǔn)度不得小于2.3；吸光度的范圍在標(biāo)準(zhǔn)值范圍的±5%內(nèi)，且最大的吸光程度不得大于2；分光光度計的運行穩(wěn)定性變化不得超過標(biāo)準(zhǔn)值的0.02；分光光度計的精準(zhǔn)程度見表2。

表2 分光光度計吸光精準(zhǔn)程度表Table 2 Spectrophotometer absorption precision degree table

首先進(jìn)行雜散光的測試，由于分光光度計在340 nm紫外線環(huán)境中的感光能力較弱，相對于其他測定設(shè)備信噪比較低，導(dǎo)致雜散光的干擾對測定結(jié)果有著較大的影響，測定時需要應(yīng)用濃度達(dá)到100 mL/L的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液作為測試樣本，用蒸餾水作為該測試實驗的對比因變量，獲取蒸餾水的雜散光測定結(jié)果為4.02，符合標(biāo)準(zhǔn)要求[10]。

再測試分光光度計吸光度準(zhǔn)確性，分別應(yīng)用濃度為50，60 mL/L的重鉻酸鉀溶液與亞硝酸鈉溶液進(jìn)行吸光測定，在分光光度計中分別進(jìn)行3次重復(fù)性測試，計算3次測試平均值來衡量改良法分光光度計的吸光準(zhǔn)確度。吸光度準(zhǔn)確度測量數(shù)據(jù)見表3。

表3吸光度準(zhǔn)確度測量數(shù)據(jù)Table 3 Absorbance accuracy measurement data

最后對分光光度計的吸光度范圍進(jìn)行測試，根據(jù)改良法分光光度計的標(biāo)準(zhǔn)吸光度閾值可知，分光光度計能夠確定食品中亞硝酸鈉含量的可測試光波長在250～350 nm之間。

為了能夠保障分光光度計在一定范圍內(nèi)的波長進(jìn)行穩(wěn)定測試，本文將按照食品中亞硝酸鈉原液含量的配比進(jìn)行重新配制分光光度計可識別色素，色素原液的配比原料見表4。

表4 色素原液的配比原料Table 4 The raw materials' ratios of pigment stock solution

分光光度計在食品中識別出的亞硝酸鈉測定含量的整體結(jié)果受到吸光度的范圍性影響，而本文按照吸光度中的兩種重要組成溶質(zhì)的不同比例來計算吸光度的間接表現(xiàn)數(shù)據(jù)。

重鉻酸鉀溶質(zhì)和橘紅G在分光光度計中表現(xiàn)的吸光度測試數(shù)據(jù)見表5和表6。

表5 重鉻酸鉀溶質(zhì)在分光光度計中的吸光度測試數(shù)據(jù)Table 5 The testing data of absorbance of potassium dichromate solute in spectrophotometer

表6 橘紅G溶質(zhì)在分光光度計中的吸光度測試數(shù)據(jù)Table 6 The testing data of absorbance of orange G solute in spectrophotometer

續(xù) 表

由表5和表6可知，兩種溶質(zhì)在分光光度計中對亞硝酸鈉吸光準(zhǔn)確度的范圍影響程度小于10%，達(dá)到了實驗進(jìn)行的基本要求。

2 結(jié)果與分析

應(yīng)用改良法分光光度計在肉類食品中測定的亞硝酸鈉波長為534 nm，分別在不同濃度溶液與標(biāo)準(zhǔn)液中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)度的測試與吸光度等因素的測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本中測定數(shù)據(jù)與樣品中亞硝酸鈉的測定數(shù)據(jù)共同獲取曲線公式，從而計算得到亞硝酸鈉在食品中的精準(zhǔn)數(shù)據(jù)。改良法分光光度計中測量的亞硝酸鈉制備溶液參數(shù)見表7。

設(shè)定亞硝酸鈉質(zhì)量在分光光度計中的工作曲線為橫坐標(biāo)值，吸光度在分光光度計工作曲線中為縱坐標(biāo)值，亞硝酸鈉在分光光度計中的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖見圖3。

改良法下的分光光度計工作曲線計算公式為：

式中：X代表食品中亞硝酸鈉的含量，mg/kg；A代表實驗測量樣品中亞硝酸鈉在分光光度計中的質(zhì)量，μg；m代表食品中的亞硝酸鈉質(zhì)量，g；V代表樣品溶液的體積，mL；V0代表分光光度計中的樣品總體積。應(yīng)用公式對改良法下的分光光度計中樣品溶液亞硝酸鈉含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表8。

實驗中兩次的含量測定結(jié)果分別為3.23 g與5.36 g，兩次的亞硝酸鈉含量測定均具有獨立性，平均值與相應(yīng)的具體精準(zhǔn)數(shù)據(jù)活動范圍在10%內(nèi)，符合標(biāo)準(zhǔn)的分光光度計計劃結(jié)果，根據(jù)GB 2760-2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中亞硝酸鈉的食品添加劑注意事項中可知，大多數(shù)應(yīng)用亞硝酸鈉添加劑的食品中會有大量的殘留，當(dāng)肉類食品中亞硝酸鈉的殘留量小于30 mg/kg時則證明實驗中的亞硝酸鈉含量在合格的范圍內(nèi)，因此能夠?qū)κ称分衼喯跛徕c含量的精準(zhǔn)測定關(guān)乎食品的質(zhì)量是否合格。

本實驗先應(yīng)用文獻(xiàn)[1]中的色譜對比法進(jìn)行食品亞硝酸鈉含量測定，應(yīng)用電子秤稱取n質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品，樣品中引用的相對標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量評定方法。根據(jù)量筒中樣品的標(biāo)準(zhǔn)測定參數(shù)確定色譜對比方法中容易引起實驗結(jié)果變化的原因，對樣品進(jìn)行定容與實驗環(huán)境的改善，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下溫度的變化范圍在±5 ℃內(nèi)，樣品在標(biāo)準(zhǔn)溶劑中的膨脹系數(shù)確定為2.36×10-3/℃，假設(shè)亞硝酸鈉在量筒中的分布狀態(tài)均勻，進(jìn)行色譜對比獲取亞硝酸鈉含量數(shù)據(jù)。再用電化學(xué)分析法，將含有亞硝酸鈉的食品用電子秤稱取相同質(zhì)量的樣品，應(yīng)用電解析的方式獲取食品中亞硝酸鈉的含量，再用電子秤稱取經(jīng)過電解后的亞硝酸鹽，利用質(zhì)量的差值獲取亞硝酸鈉的含量數(shù)據(jù)。對3種不同的測定方法進(jìn)行對比，測定食品中亞硝酸鈉的精準(zhǔn)程度結(jié)果，見圖3。

圖3 測定食品中亞硝酸鈉的精準(zhǔn)程度結(jié)果Fig.3 The determination results of the accuracy of sodium nitrite in food

由圖3可知，本文應(yīng)用的改良法下的分光光度計對食品中亞硝酸鈉含量測定精準(zhǔn)度更高。改良法下分光光度計中添加氨基苯磺酸溶液與鹽酸萘乙二胺等化學(xué)物質(zhì)提高亞硝酸鈉在分光光度計中的測定有效量。

3 結(jié)束語

本文根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.33-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度計進(jìn)行改良后的測定方法進(jìn)行食品中亞硝酸鈉含量的測定，具有操作簡單、測定精準(zhǔn)程度高、干擾因素少、測定結(jié)果體現(xiàn)快等優(yōu)勢，通過可見光的形式即可表現(xiàn)出亞硝酸鈉含量。測定實驗中首先應(yīng)用6組樣品作為分光光度計的測定含量的對比組，取幾組樣品的測定平均值為最終的測量結(jié)果依據(jù)。根據(jù)實驗的最終數(shù)據(jù)可知，文獻(xiàn)[1]、文獻(xiàn)[2]中應(yīng)用的方法對亞硝酸鈉含量測定精準(zhǔn)度均小于本文方法的測定精準(zhǔn)度。