董翠芳，閆曉燕，李煦，劉樹恒，劉長霞

(滄州師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，河北 滄州 061001)

桑葚是桑樹成熟的果實(shí)，又名桑果、桑棗、桑烏等，是國家首批納入藥食同源的食材，被譽(yù)為“民間圣果”、“百果之先”[1-2]。桑葚中最主要的生物活性成分為花色苷，花色苷是一種天然色素，安全無毒，且具有抗氧化、抗輻射、抗癌、保護(hù)心腦血管等功效[3-5]，在保健品、食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。由于桑葚成熟的季節(jié)性很強(qiáng)，且無果皮、外表易破損、易變質(zhì)、不易保存和運(yùn)輸，因此，開發(fā)桑葚的深加工技術(shù)更有利于桑葚的綜合利用，增加產(chǎn)品附加值。

目前花色苷的提取方法主要有：溶劑萃取法、酶法提取、超臨界CO2提取、超高壓提取、微波輔助提取、超聲波輔助提取等[6-10]。其中溶劑萃取法最為傳統(tǒng)，具有操作簡便、設(shè)備簡單的優(yōu)點(diǎn)，但是同時(shí)也存在花費(fèi)時(shí)間較長、提取率低的缺點(diǎn)。

超聲-微波協(xié)同提取法是將微波和超聲振動(dòng)作用方式相結(jié)合的一種提取方法[11]，充分利用超聲波的空化作用以及微波的熱效應(yīng)，克服了常規(guī)的微波提取傳熱、傳質(zhì)不均，超聲波提取產(chǎn)熱不足的問題，還實(shí)現(xiàn)了在低溫條件下的提取操作，避免了高溫對(duì)天然產(chǎn)物有效成分的破壞。

本試驗(yàn)采用超聲-微波協(xié)同輔助溶劑萃取桑葚中的花色苷，以花色苷提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化花色苷的提取工藝，通過抗氧化性試驗(yàn)分析其抗氧化能力，旨在為桑葚的綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

桑葚粉：選用滄州泊頭地區(qū)的桑葚干，在干燥箱內(nèi)60 ℃下烘干至恒重后取出晾涼，粉碎過100目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

無水乙醇、濃鹽酸、氯化鉀、抗壞血酸(Vc)、無水乙酸鈉(均為分析純)：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，分析純)：上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水楊酸(化學(xué)純)：上海試劑一廠；雙氧水(分析純)：河北省保定化學(xué)試劑廠；硫酸鐵(分析純)：天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站。

XO-SM200型超聲微波組合反應(yīng)儀 南京先歐儀器制造有限公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；722型可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；SL-100型高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市松青五金廠；FA2004N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；金怡TDL-5型低速臺(tái)式大容量離心機(jī) 江蘇省金壇醫(yī)療儀器廠；202-Z型干燥箱 上海試驗(yàn)儀器有限公司；PHSJ-3F型pH計(jì) 廣州市新英電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 桑葚花色苷的提取

稱取一定質(zhì)量桑葚粉，加入適量酸化乙醇(含1% HCl)提取劑混合均勻，超聲-微波協(xié)同提取，提取液離心定容，利用pH示差法測定花色苷提取率。

2.2 pH示差法測定花色苷提取率

根據(jù)文獻(xiàn)[12]，采用雙波長pH示差法測定花色苷提取率，取兩份2 mL花色苷提取液，用兩種不同的pH緩沖溶液(pH 1.0的氯化鉀-鹽酸緩沖液、pH 4.5的醋酸鈉-鹽酸緩沖液)稀釋定容，在黑暗中平衡30 min后取出，測定在510 nm和700 nm處的吸光度，用蒸餾水做參比。

式中：A=(A510-A700)pH 1.0-(A510-A700)pH 4.5；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26900 L/(mol·cm)；m為樣品質(zhì)量；L為標(biāo)準(zhǔn)光程，1 cm；γ為花色苷提取率，mg/g。

2.3 單因素試驗(yàn)

通過對(duì)花色苷提取的相關(guān)文獻(xiàn)[13-14]調(diào)研發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)試驗(yàn)的最佳條件中，提取溫度為40～60 ℃,提取時(shí)間為20～40 min，因此本試驗(yàn)固定提取溫度50 ℃、提取時(shí)間30 min，主要探討超聲波功率、微波功率、提取劑濃度、料液比改變對(duì)花色苷提取率的影響。

2.3.1 超聲波功率對(duì)桑葚花色苷提取率的影響

稱取桑葚粉末3.00 g，在酸化乙醇濃度60%、料液比3∶90 (g/mL)、微波功率200 W條件下，改變超聲波功率120，240，360，480，600 W進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3.2 微波功率對(duì)桑葚花色苷提取率的影響

稱取桑葚粉末3.00 g，在酸化乙醇濃度60%、料液比3∶90 (g/mL)、超聲波功率360 W條件下，改變微波功率100，150，200，250，300 W進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3.3 乙醇溶液濃度對(duì)桑葚花色苷提取率的影響

稱取桑葚粉末3.00 g，在料液比3∶90 (g/mL)、微波功率150 W、超聲波功率360 W條件下，改變酸化乙醇溶液的濃度50%、60%、70%、80%、90%進(jìn)行試驗(yàn)。

2.3.4 料液比對(duì)桑葚花色苷提取率的影響

固定提取劑90 mL，在酸化乙醇濃度70%、微波功率150 W、超聲波功率360 W條件下，改變料液比1∶90、2∶90、3∶90、4∶90、5∶90 (g/mL)進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)(見表1)，以桑葚花色苷提取率為響應(yīng)值，采用BBD模型對(duì)花色苷提取的最佳條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 The factors and levels of response surface experiment

2.5 花色苷抗氧化性試驗(yàn)

花色苷提取液和相應(yīng)Vc溶液的濃度梯度分別為質(zhì)量濃度0.05，0.15，0.25，0.35，0.45 mg/mL，按照文獻(xiàn)[15]的操作方法進(jìn)行花色苷清除羥自由基和DPPH自由基能力的測定試驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 超聲波功率對(duì)花色苷提取率的影響

圖1 超聲波功率對(duì)花色苷提取率的影響Fig.1 The effect of ultrasonic power on extraction rate of anthocyanins

由圖1可知，花色苷提取率隨著超聲波功率的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在超聲波功率為360 W時(shí)出現(xiàn)最大值。原因可能是：隨著超聲波功率的逐漸增大，桑葚渣的細(xì)胞壁被超聲波的空化作用在短時(shí)間內(nèi)破壞，使花色苷快速溶出，從而導(dǎo)致花色苷的提取率增加。但當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，桑葚花色苷不穩(wěn)定，易分解[16]。所以360 W的超聲波功率最佳，提取效果最好。

3.1.2 微波功率對(duì)花色苷提取率的影響

圖2 微波功率對(duì)花色苷提取率的影響Fig.2 The effect of microwave power on extraction rate of anthocyanins

由圖2可知，微波功率為150 W時(shí)，花色苷提取率出現(xiàn)最大值。原因可能是：微波功率小于150 W時(shí)，隨著微波功率的增大，微波的輻射作用穿透桑葚細(xì)胞壁，利于花色苷溶出。微波功率大于150 W，可能會(huì)造成花色苷的降解，故出現(xiàn)測定的花色苷提取率下降的情況[17]。所以150 W的微波功率最佳，提取效果最好。

3.1.3 酸化乙醇濃度對(duì)花色苷提取率的影響

圖3 酸化乙醇濃度對(duì)花色苷提取率的影響Fig.3 The effect of acidified ethanol concentration on extraction rate of anthocyanins

由圖3可知，在乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)花色苷的提取率最大。原因可能是：濃度過低，提取液的極性較大，有利于糖類或其他水溶性物質(zhì)溶出，影響了花色苷的溶出，因此提取率較低；反之，提取劑極性過小，水溶性花色苷與提取劑相容性較低，也會(huì)影響花色苷的溶出。所以70%的乙醇溶液最佳，提取效果最好。

3.1.4 料液比對(duì)花色苷提取率的影響

圖4 料液比對(duì)花色苷提取率的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on extraction rate of anthocyanins

由圖4可知，當(dāng)料液比為3∶90 (g/mL)時(shí)提取率達(dá)到最大。原因可能是：在提取液固定為90 mL的情況下，增加桑葚粉的質(zhì)量，花色苷溶出增多，但當(dāng)桑葚粉質(zhì)量超過5 g時(shí)，溶液濃度較大，基質(zhì)受到超聲波和微波的影響不均勻，導(dǎo)致細(xì)胞破裂不完全，花色苷提取率下降。所以料液比為3∶90 (g/mL)時(shí)花色苷的提取效果最佳。

3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

3.2.1 響應(yīng)面結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 RSM design and results

續(xù) 表

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)過二次回歸擬合后，得出花色苷提取率為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：

Y=13.7-0.24A+0.27B+0.21C-0.56D+0.15AB-0.35AC-0.52AD-0.05BC-0.27BD-0.28CD-1.76A2-2.18B2-2.26C2-2.21D2。

對(duì)該方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

由表3可知，失擬項(xiàng)P值為0.0988，不顯著，說明該響應(yīng)面模型存在的誤差較小，因此二次模型較合理。此模型的R2為0.9303，呈現(xiàn)極顯著性，表明該模型在桑葚花色苷的試驗(yàn)值和擬合值間有較高的擬合度[18]。通過因素顯著性來分析模型系數(shù)，可以明顯得出D、A2、B2、C2、D2均體現(xiàn)出極顯著性。

3.2.2 響應(yīng)面分析

各因素對(duì)桑葚花色苷提取率的影響及各因素之間的交互作用見圖5。

a.超聲波功率、乙醇濃度的交互作用

b.超聲波功率、微波功率的交互作用

c.料液比、乙醇濃度的交互作用

d.微波功率、乙醇濃度的交互作用

e.料液比、微波功率的交互作用

f.料液比、超聲波功率的交互作用

等高線和響應(yīng)曲面圖直觀地反映了4個(gè)因素對(duì)花色苷提取率的影響。從等高線來看，越接近橢圓，交互作用越顯著，從3D曲面圖來看，曲面越陡峭交互作用越顯著，圖5中a，c，e，f 等高線接近橢圓，說明超聲波功率和乙醇濃度、料液比和乙醇濃度、料液比和微波功率、料液比和超聲波功率的交互作用對(duì)桑葚花色苷提取率影響顯著；圖5中b,d的等高曲線接近圓形，說明超聲波功率和微波功率、微波功率和乙醇濃度的交互作用對(duì)桑葚花色提取率影響不顯著。

3.2.3 響應(yīng)面的最佳工藝條件

利用響應(yīng)面分析得出桑葚花色苷的最佳提取工藝：A料液比2.9∶90 (g/mL)，B超聲波功率367.6 W，C微波功率152.6 W，D乙醇濃度68.8%，花色苷提取率達(dá)到 13.75 mg/g。根據(jù)試驗(yàn)儀器的現(xiàn)實(shí)情況，調(diào)整最佳工藝為：A料液比為3∶90 (g/mL)，B超聲波功率360 W，C微波功率150 W，D乙醇濃度70%。在該條件下進(jìn)行平行試驗(yàn)，提取率分別為13.8，13.6，13.3 mg/g，平均值為13.57 mg/g，與理論值相比較，其相對(duì)誤差為-1.3%。結(jié)果表明，響應(yīng)面分析得到的最佳條件穩(wěn)定，重復(fù)性好，可行性高。

3.3 花色苷抗氧化性測定

3.3.1 羥自由基清除率的測定

圖6 羥自由基清除試驗(yàn)Fig.6 The experimental results of scavenging of hydroxyl radicals

由圖6可知，桑葚花色苷的羥自由基清除率隨著濃度的增大而上升，當(dāng)花色苷濃度為0.45 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率為83.5%，遠(yuǎn)高于相同濃度Vc的羥自由基清除率54.6%，這與耿然等、張鏡等[19-20]的研究結(jié)果一致，說明桑葚花色苷具有良好的清除羥自由基效果。

3.3.2 DPPH自由基消除率的測定

圖7 DPPH自由基清除試驗(yàn)Fig.7 The experimental results of scavenging of DPPH radicals

由圖7可知，隨著桑葚花色苷濃度的增加，其清除DPPH能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)花色苷濃度為0.45 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為89.3%，遠(yuǎn)高于相同濃度Vc的DPPH自由基清除率61%，說明桑葚花色苷具有很強(qiáng)的體外清除DPPH自由基的能力。

4 結(jié)論

以桑葚為原料，采用超聲-微波協(xié)同提取桑葚花色苷，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)論如下：

響應(yīng)面優(yōu)化了花色苷的最佳提取工藝條件：料液比3∶90 (g/mL)、酸化乙醇濃度70%、超聲波功率360 W、微波功率150 W，在此參數(shù)下花色苷的提取率最大，為(13.57±1.3) mg/g。

抗氧化性試驗(yàn)研究表明，桑葚花色苷對(duì)羥自由基和DPPH自由基的清除能力隨著花色苷濃度的增加而增大，并且花色苷對(duì)兩種自由基的清除率遠(yuǎn)高于同等濃度Vc溶液，說明桑葚花色苷的抗氧化性能優(yōu)良，有望作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健品等行業(yè)，具有一定的開發(fā)前景。