劉祚軍，黃勝威，李明浩，吳麗芳

(1. 中國科學(xué)院 合肥物質(zhì)科學(xué)研究院， 合肥 230031； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京 100049； 3. 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程研究所， 合肥 230001)

植物在受到外界環(huán)境脅迫時(shí)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，并通過產(chǎn)生活性氧建立防御機(jī)制。然而，活性氧的產(chǎn)生是不可控的，過量的活性氧又會(huì)引起對植物體蛋白質(zhì)、脂類、核酸等的損傷[1]。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一類廣泛存在的金屬酶，負(fù)責(zé)清除生物體內(nèi)有害的活性氧，被認(rèn)為是衡量植物抗逆性狀的一種重要指標(biāo)蛋白[2-3]。根據(jù)活性中心結(jié)合金屬離子的不同，SOD分為銅鋅超氧化物歧化酶(Cu, Zn superoxide dismutase， Cu, Zn-SOD)、鐵超氧化物歧化酶(Fe superoxide dismutase，F(xiàn)e-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase，Mn-SOD)和鎳超氧化物歧化酶(Ni superoxide dismutase，Ni-SOD)等4類。其中，在高等植物中，Cu, Zn-SOD在體內(nèi)含量最高、分布也最為普遍，因此，其相關(guān)研究具有重要的理論和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)意義[4]。

擬南芥(Arabidopsisthaliana)是重要的模式生物，已發(fā)現(xiàn)有7個(gè)SOD酶，其中，擬南芥銅鋅超氧化物歧化酶(Arabidopsisthalianasuperoxide dismutase 1，AtSOD1)被推測為一個(gè)大小為32 ku的同源二聚體，是理想的研究植物SOD酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的模式蛋白[5-6]。

目前，對AtSOD1的研究仍不夠深入，因此其在體內(nèi)表達(dá)調(diào)控機(jī)制依舊不明[7]。其主要原因有兩個(gè)方面：一是生物體內(nèi)條件復(fù)雜，導(dǎo)致機(jī)理研究困難；二是對于該酶本身的性質(zhì)，如穩(wěn)定性、活性特別是結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系等基本信息了解不夠充分，這在很大程度上限制了相關(guān)研究的開展。本研究結(jié)合圓二色譜(Circular dichroism，CD)、差示掃描量熱法(Differential scanning calorimetry，DSC)、電子順磁共振波譜(Electron paramagnetic resonance，EPR)等方法對AtSOD1酶的基本性質(zhì)進(jìn)行表征，以期為AtSOD1酶結(jié)構(gòu)與功能以及金屬配位結(jié)構(gòu)研究提供方法學(xué)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 AtSod1的克隆、表達(dá)與蛋白質(zhì)純化

采集擬南芥新鮮嫩葉(約40 d) 50～100 mg，按照 Trizol RNAiso Plus 試劑盒說明書提取總RNA，以總RNA為模板，利用Super Script II反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，再以此為模板，根據(jù)AtSod1(NCBI 序列號(hào)：X60935.1)的序列設(shè)計(jì)引物(正義引物：5′-GGAATTCCATATGGCGAAAGGAGTTGCAGT-3′；反義引物：5′-CCCAAGCTTTTAGCCCTGGAGACCAATGA-3′)，擴(kuò)增AtSod1，將擴(kuò)增片段克隆到pET-28a載體(Novagen)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta菌株，28 ℃，培養(yǎng)至OD600約0.8時(shí)，1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，超聲破碎，取上清液，蛋白質(zhì)經(jīng)Ni-NTA樹脂(Novagen)親和層析和HiprepTm16/60 SephacrylTmS-200 HR分子篩純化，透析處理濃縮后用于后續(xù)分析。

1.2 AtSOD1的濃度和Km值測定

使用改良型 Bradford 法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工，產(chǎn)品編號(hào)C503041)進(jìn)行蛋白濃度的測定。595 nm處測定吸光度值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度。具體方案詳見產(chǎn)品說明書。

Km測定：酶的濃度不變，通過改變底物自由基的量來測定。Km值等于酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)所對應(yīng)的底物濃度。

1.3 AtSOD1的活性中心金屬配位表征

利用電子順磁共振技術(shù)測定SOD酶的活性中心Cu的配位結(jié)構(gòu)[8]。樣品質(zhì)量濃度根據(jù)SOD酶中的銅離子含量而定，一般不低于0.5 mg/mL即可。樣品要在液氦溫度20 K測定，X波段，微波功率6.33 mW，微波頻率9.39 GHz，磁場調(diào)頻100 KHz，磁場調(diào)幅1～10 Gs(視樣品情況而定，通常5 Gs)，掃描時(shí)間24 s，掃描次數(shù)1～20次(視樣品情況而定，通常10次)。

1.4 AtSOD1的化學(xué)穩(wěn)定性分析

利用尿素(Urea)對SOD酶進(jìn)行化學(xué)解疊，以圓二色譜來測定二級結(jié)構(gòu)的變化，分析其化學(xué)穩(wěn)定性。具體方法為，先根據(jù)蛋白的濃度，設(shè)置一定的梯度，將蛋白的CD初始峰值設(shè)置在-30～-20為宜，便于下一步結(jié)構(gòu)解疊時(shí)的觀察。尿素解疊蛋白反應(yīng)的總體積為500 μL，SOD酶的濃度恒定，尿素濃度設(shè)置合理的梯度(0～8 mol/L)，余下的體積由buffer補(bǔ)平。掃描時(shí)，采取較慢的掃描速度和較長的響應(yīng)時(shí)間提高信噪比。

1.5 AtSOD1的物理穩(wěn)定性分析

利用差示掃描量熱儀法測定SOD樣品。該方法中，質(zhì)量濃度要求5 mg/mL以上，溫度先升到120 ℃，然后緩慢降到25 ℃，在降溫過程中觀察比熱容值的變化，計(jì)算蛋白質(zhì)處于中間態(tài)時(shí)的Tm值。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtSOD1的表達(dá)與純化

經(jīng)預(yù)測分析，AtSOD1經(jīng)pET-28a載體表達(dá)后，氨基酸數(shù)目為172個(gè)，分子質(zhì)量約18 ku，等電點(diǎn)為6.05。誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)鑒定目標(biāo)酶蛋白主要在上清液中，因此取上清液用于下一步的親和層析。親和層析結(jié)果顯示，雜蛋白帶明顯。因此進(jìn)一步進(jìn)行分子篩純化，獲得目標(biāo)酶蛋白(圖1)。

2.2 AtSOD1的含量與Km值測定

經(jīng)測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度，制定了標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)的方程為Y=0.005 73X。

圖1 AtSOD1的分子篩純化結(jié)果

通過黃嘌呤氧化酶體系測試了SOD的酶催化動(dòng)力學(xué)，相應(yīng)的酶的米氏常數(shù)為km=0.2 μmol/L，具體見圖2。

2.3 AtSOD1的活性中心金屬配位表征

Cu, Zn-SOD酶在進(jìn)化上比較保守，分子中的Cu為二價(jià)，具有順磁性[4]。AtSOD1的低溫EPR結(jié)果顯示，其具有典型的二價(jià)銅的特征峰，不過信號(hào)比較弱。將蛋白濃縮至10 mg/mL左右時(shí)，信號(hào)并沒有明顯的增強(qiáng)，表明AtSOD1中銅離子的含量很低。

圖2 AtSOD1的Km值

細(xì)胞中的銅離子90%結(jié)合到銅藍(lán)蛋白中，極少以游離的一價(jià)銅存在[9]。在真核生物中，Cu, Zn-SOD的成熟需要銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Copper chaperone for superoxide dismutase1，CCS)作為伴侶分子。該蛋白可以通過和SOD酶間的相互作用來傳遞銅到達(dá)它的目的地，并幫助SOD酶正確折疊具備催化活性[10]。

Cu, Zn-SOD在酵母表達(dá)時(shí)，由于本身具有CCS蛋白，因此很容易表達(dá)出折疊正確的活性蛋白[11]。而在大腸桿菌中，由于本身不含CCS蛋白，因此表達(dá)出來的SOD酶生物活性往往很低，不過，通過共表達(dá)CCS蛋白也可以表達(dá)出活性Cu, Zn-SOD[10]。

圖3 外源銅鋅離子影響活性AtSOD1酶表達(dá)的EPR表征

分別通過向培養(yǎng)基中補(bǔ)充終濃度10 μmol/L CuSO4、4 μmol/L Zn (NO3)2和100 μmol/L CuSO4、40 μmol/L Zn (NO3)2兩個(gè)梯度，誘導(dǎo)表達(dá)AtSOD1[4]。提取純化后，將蛋白質(zhì)濃度校準(zhǔn)為500 μg/mL，進(jìn)行低溫EPR檢測，結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，隨著外源補(bǔ)充金屬離子濃度的增加，EPR信號(hào)依次增強(qiáng)，顯示正相關(guān)性。EPR擬合結(jié)果顯示，關(guān)鍵參數(shù)g值沒有發(fā)生改變，說明Cu2+正確結(jié)合到SOD中。

2.4 AtSOD1的化學(xué)穩(wěn)定性

分別以天然態(tài)AtSOD1(holo態(tài))和去除金屬離子的AtSOD1(apo態(tài))為研究對象，利用尿素(Urea)對SOD酶進(jìn)行化學(xué)解折疊，然后通過測定其CD結(jié)構(gòu)的變化來對它的穩(wěn)定性進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，解折疊態(tài)與holo態(tài)相比，α-螺旋的比例由13.6% 增至30.9%，β-折疊由43.6%降為0.0%，β-轉(zhuǎn)角由原來的 11.6%增加至37.5%。結(jié)果表明，對于AtSOD1來說，β-折疊是維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要因素[12]。

以往研究[13-14]表明，SOD酶尿素解折疊反應(yīng)時(shí)，與apo態(tài)相比，holo態(tài)的二級結(jié)構(gòu)對尿素不敏感。本研究表明，利用尿素處理AtSOD1，不論是apo態(tài)還是holo態(tài)，解折疊曲線均發(fā)生了明顯的向長波方向的紅移現(xiàn)象，即β-折疊比例減少，α-螺旋增加，且在225 nm附近出現(xiàn)了一個(gè)拐點(diǎn)(圖4)。進(jìn)一步分析0～8 mol/L尿素處理AtSOD1后225 nm處波長的變化。結(jié)果顯示，apo態(tài)AtSOD1加入一定濃度的尿素后，迅速解折疊，這可能與失去金屬離子后AtSOD1的穩(wěn)定性下降有關(guān)[13]。而holo態(tài)AtSOD1尿素處理結(jié)果顯示，在尿素濃度達(dá)到4～5 mol/L時(shí)，解折疊曲線出現(xiàn)了平臺(tái)期，這在以往的文獻(xiàn)中未見報(bào)道(圖5)。推測認(rèn)為該平臺(tái)期與holo態(tài)AtSOD1二聚體解聚為單體的過程有一定的關(guān)聯(lián)。

(a)holo態(tài)的解折疊結(jié)果；(b)apo態(tài)解折疊的結(jié)果。二者皆在約225 nm處出現(xiàn)拐點(diǎn)

A：holo態(tài)AtSOD1；B：apo態(tài)AtSOD1

2.5 AtSOD1的物理穩(wěn)定性

研究表明，Cu, Zn-SOD酶耐高溫，在75 ℃時(shí)，構(gòu)象不發(fā)生明顯變化，但仍具有酶的催化活性，一般認(rèn)為與金屬離子Cu2+和Zn2+的存在有關(guān)[13]。比熱容是熱力學(xué)中常用的一個(gè)物理概念，是單位質(zhì)量物質(zhì)的熱容量，即單位質(zhì)量物體改變單位溫度時(shí)吸收或放出的熱量，屬于物質(zhì)本身的屬性，具有指紋屬性。對于蛋白質(zhì)來說，每一個(gè)比熱容值對應(yīng)著相應(yīng)的相對穩(wěn)定的構(gòu)象，Tm值是處在兩種狀態(tài)之間的中間態(tài)，Tm值越低，某種程度上意味著穩(wěn)定性越差[15]。

將AtSOD1加入DSC儀中，迅速升溫到120 ℃，然后緩慢降到25 ℃，觀察Tm值的變化(圖6)。結(jié)果顯示，對于 holo態(tài)AtSOD1來說，存在兩個(gè)Tm值，分別為102.2 ℃和100.5 ℃，前一個(gè)值反映了AtSOD1完全解折疊的狀態(tài)，另一個(gè)Tm值反映了AtSOD1的何種結(jié)構(gòu)狀態(tài)仍不得而知。對人類和牛的SOD1的DSC研究顯示，holo態(tài)的Tm值為92 ℃和96 ℃，apo態(tài)的Tm值為54 ℃和50 ℃[16-17]。上述結(jié)果和AtSOD1的結(jié)果非常類似，區(qū)別在于holo態(tài)AtSOD1的結(jié)果出現(xiàn)了比鄰的雙峰。結(jié)合尿素解折疊AtSOD1的CD結(jié)果來看，該Tm值可能與CD二級結(jié)構(gòu)平臺(tái)期的結(jié)果互為呼應(yīng)，故進(jìn)一步認(rèn)為這些結(jié)果反映了SOD蛋白質(zhì)從二聚體解聚為單體過程中的一個(gè)中間態(tài)。此外，對于apo態(tài)AtSOD1來說，Tm值為54.6 ℃，說明去除金屬離子后，酶的穩(wěn)定下降。以二硫蘇糖醇(DTT)還原二硫鍵后，apo態(tài)AtSOD1的Tm值進(jìn)一步下降為46.5 ℃，這表明金屬離子和鏈間二硫鍵是SOD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重要因素[13]。

reduced-apo態(tài)為二硫鍵被還原的apo蛋白

3 結(jié)論

本研究重點(diǎn)對At-SOD1酶的化學(xué)和物理穩(wěn)定性進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)了該酶由二聚體解折疊為單體過程中的一個(gè)中間態(tài)，且CD結(jié)果和DCS結(jié)果互為驗(yàn)證。推測認(rèn)為，該中間態(tài)反映了酶由二聚體解聚為單體過程中的特殊狀態(tài)，該發(fā)現(xiàn)尚屬首次，其可能對于酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起著一定的作用。

此外，本研究通過在培養(yǎng)基外源補(bǔ)充二價(jià)銅和二價(jià)鋅離子，獲得了具有完整結(jié)構(gòu)的AtSOD1，無須通過銅離子螯合柱親和層析純化。純化的酶蛋白反映出良好EPR光譜特征，滿足EPR檢測要求，為該酶的后續(xù)金屬配位研究打下方法學(xué)基礎(chǔ)。