閔 杰, 曹 丹, 韓 梅
(南京林業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境學(xué)院 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210037)
楊樹在全球共有100多種,是世界上分布范圍最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的樹種之一[1]。相比于其他速生豐產(chǎn)林樹種, 楊樹有著更高的養(yǎng)分需求量,尤其是氮營養(yǎng)元素[2]。先前有研究表明供氮水平會調(diào)控根系生長和植物形態(tài)變化,如根系形態(tài)及構(gòu)型的變化[3]、葉片形態(tài)的改變[4]、生物量在地上及地下分配的調(diào)節(jié)[5]等。氮素量的多少直接影響楊樹的材積量與胸徑, 在一定的氮素內(nèi),它們成正比,但氮素過高會產(chǎn)生抑制效果。隨著氮素濃度的升高,楊樹木材部分木質(zhì)素含量有下降趨勢[6],根系生長受到抑制,導(dǎo)致根冠比降低[7-8]。
從AspAT催化的生化反應(yīng)和其在代謝網(wǎng)絡(luò)所處的位置推測,AspAT在植物氮代謝通路中有非常重要的作用,包括:1)跟種子萌發(fā)過程中氮素的轉(zhuǎn)移有關(guān);2)參與營養(yǎng)器官的氮素代謝循環(huán)和轉(zhuǎn)運(yùn);3)協(xié)調(diào)氮素從源到庫的再分配;4)與種子的氮充實和成熟有關(guān)[13]。近年來,科研人員[11-12,15-16]在擬南芥等植物中對AspAT在植物體內(nèi)的功能作用進(jìn)行了廣泛的探索,初步證明AspAT在細(xì)胞內(nèi)參與氮和碳代謝平衡,對作物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成有重大的影響。根據(jù)對擬南芥和其他物種的序列鑒定、聚類分析,AspAT可分為兩大家族:Iα和Iβ,兩者序列相似度為15%左右[17]。Iα包含真核生物中的AspAT,Iβ則包括了原核型的AspAT。原核型的AspAT是雙功能酶,除了具有天冬氨酸酶的功能外,還具有預(yù)苯酸氨基轉(zhuǎn)化酶(PAT,prephenate aminotransferase)的功能[17]。AspAT家族基因至少分布在3個不同類型的細(xì)胞器中, 包括質(zhì)體、細(xì)胞質(zhì)和線粒體[11-12, 15]。
本課題組在先前研究[18]中,已在楊樹中鑒定了10個編碼PtAspAT蛋白的家族基因。然而,這些基因在毛果楊體內(nèi)的生理功能和調(diào)控方式尚不清楚。本實驗旨在通過對毛果楊幼苗設(shè)立3種不同濃度(0、2和10 mmol/L)氮處理,利用非變性膠的方式測定毛果楊中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶3種類型同工酶在不同組織部分的酶活性差異,同時通過實時熒光定量PCR(qPCR)研究PtAspAT家族10個基因相應(yīng)的表達(dá)量變化,探討PtAspAT在楊樹缺氮、正常氮和高氮條件下的酶活性和基因表達(dá)變化規(guī)律,以期更深入地了解天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶在楊樹氮代謝過程中的分子機(jī)制,為提高楊樹的氮利用率提供科學(xué)基礎(chǔ)。
采用毛果楊(Populustrichocarpa)的組培無菌苗,并使用含0.1 mg/L IBA的MS 培養(yǎng)基[19]進(jìn)行繼代培養(yǎng),生長條件為:溫度 25 ℃,16 h/8 h(光照/黑暗)。
1.2.1 不同氮濃度培養(yǎng)基配制
在基本MS培養(yǎng)基中去除硝酸鉀與硝酸銨,并添加0、1和5 mmol/L的硝酸銨,作為3種不同類型的氮梯度(0、2和10 mmol/L)培養(yǎng)基,對應(yīng)楊樹缺氮、正常氮和高氮處理[20]。
1.2.2 樣本處理
從分化培養(yǎng)基選取高度一致的小苗,轉(zhuǎn)接到MS生根培養(yǎng)基,待根長出1 cm左右,轉(zhuǎn)入各濃度氮處理培養(yǎng)基進(jìn)行氮處理。1個月后,收集幼葉(YL)、成熟葉(ML)、主莖(S)和根(R)等4個組織,液氮冷凍研磨并凍存于-80 ℃冰箱。
1.2.3 數(shù)據(jù)分析
在 SPSS 19.0 中,使用Kolmogorov-Smirnov檢驗和 Levene′s 檢驗對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分析和方差齊性檢驗。采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較,利用 Duncan 新復(fù)極差法檢驗處理間差異的顯著性水平(P<0.05)。
1.2.4 總RNA提取及cDNA合成
使用植物總RNA提取試劑盒RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)提取RNA,取1 μg RNA使用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)去除基因組DNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.5 組織特異性檢測
選擇毛果楊(P.trichocarpa)中UBIC基因(XM_002309363.2)作為內(nèi)參基因,使用Primer3設(shè)計引物(http://primer3.ut.ee/),具體見表1。采用TB green Premix ExTaqTM(TaKaRa)試劑盒,在Applied Biosystems StepOneTM實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)中進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系為:Premix ExTaqTM5 μL,10 μmol/L正反引物各0.2 μL,ROX reference Dye(50×)0.2 μL,模板cDNA 5 ng, 加水使反應(yīng)總體積為10 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s,共40個循環(huán)。實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct方法計算相對表達(dá)量。
1.2.6 非變性膠測定酶活性
樣本制備。參照Brauc等[21]的方法進(jìn)行酶活性測定。在液氮中將樣品研磨成粉末,之后加入2倍體積新鮮制備的提取液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,10%甘油,0.1%Triton X-100和1 mmol/L PMSF)。在4 ℃離心機(jī)以13 000 r/min離心10 min取上清即為酶提取液,通過Bradford 法(碧云天蛋白濃度測量試劑盒:貨號P0006)測取蛋白濃度,計算量取40 μg總蛋白進(jìn)行非變性電泳。
表 1 PtAspAT基因?qū)崟r熒光定量PCR引物序列
電泳及染色。實驗采用不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳法,其中濃縮膠體積分?jǐn)?shù)為4%,分離膠體積分?jǐn)?shù)為7.5%。染色底物液為0.1 mol/L的 Tris-HCl (pH 7.5),0.2 mol/L L-天冬氨酸,0.2 mol/L 2-氧戊二酸,0.1 mol/L硝酸鈣和5 g/L PVP-40,將凝膠放入染色液37 ℃孵育30 min,然后在fast violet blue溶液(2 mg/mL)中溫育直至AspAT酶活性條帶區(qū)被染成紫色帶。
本課題組前期在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(phytozome v12.1,https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中鑒定了10個PtAspAT家族基因候選成員[18]。對這10個PtAspAT基因蛋白序列進(jìn)行比對分析(圖 1),發(fā)現(xiàn)毛果楊10個PtAspAT有很高的同源性,其中有9個序列片段高度保守,它們是:1)N(V)KEYLPI;2)QS(C)LSGTGSL; 3)S(Q)PTWGNH; 4)CAHNPTG; 5)PFFDV(S)AYQGF; 6)V(M/I)AQSYS(A)KNL(M)G;7)YA(G)ERI(V)GA; 8)R(L)X2RPMY 和9)K(S)DGRISL(M)。這9個片段中每個片段至少包含1個與磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5‘-phosphate)相互作用或與乙二酸/草酸底物結(jié)合的氨基酸殘基。此外,在PtAspAT1和6中還發(fā)現(xiàn)對應(yīng)擬南芥AtPAT (AT2G22250)基因Thr84, Lys169 和 Arg445的氨基酸殘基,這些殘基在特異性識別結(jié)合預(yù)苯酸(prephenate)和天冬氨酸底物方面發(fā)揮重要作用[22]。
為進(jìn)一步了解PtAspAT的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,采用MEGA 7.0的最大相似法為毛果楊10個PtAspAT蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。如圖2所示,系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,10個PtAspATs可聚集成兩大類,即Iα和Iβ。前者包含真細(xì)菌和真核生物類型的PtAspAT,可以進(jìn)一步分成3組:Iα-A,Iα-B和Iα-C。毛果楊PtAspATs的8個成員屬于Iα家族,其中3個成員(PtAspAT3、4和10)屬于Iα-A,3個成員(PtAspAT2、7和8)屬于Iα-B, 2個成員(PtAspAT5和PtAspAT9)屬于Iα-C。另外2個成員(PtAspAT1和PtAspAT6)屬于Iβ家族。結(jié)合已有的文獻(xiàn)報道[11-12,15,18],推測這些不同類型的PtAspAT蛋白至少分布在3個不同的亞細(xì)胞器中,其中Iα-A類型的PtAspAT蛋白可能定位在細(xì)胞質(zhì)中,Iα-B類型的在線粒體中,而Iα-C和Iβ類型的則在葉綠體中。
為研究PtAspAT在植物氮代謝過程中的作用,采用不同濃度的氮(0、2和10 mmol/L)對毛果楊幼苗進(jìn)行缺氮、正常氮和高氮處理[20]。在持續(xù)1個月氮處理后,各氮濃度下植株表型發(fā)生明顯變化。如表2所示,相對于對照組(2 mmol/L的氮濃度),缺氮(0 mmol/L的氮濃度)處理顯著抑制了毛果楊生物量的積累,對地上與地下鮮重、株高和葉面積的抑制率分別達(dá)到85.588%、80.327%、49.659%和80.367%,但是根冠比顯著提高,增幅率達(dá)到33.710%。隨著氮濃度的提高,高氮(10 mmol/L的氮濃度)也會對毛果楊產(chǎn)生脅迫,相對于對照組,植株的地上鮮重、地下鮮重、株高、葉面積和根冠比均受到了顯著抑制,抑制率分別達(dá)到56.765%、81.421%、28.968%、76.821%和58.757%。這些都與植物缺氮過氮表型吻合[3-5,8]。
為研究PtAspAT酶活性變化規(guī)律,將不同濃度氮處理的毛果楊植物不同組織的酶粗提液進(jìn)行非變性膠酶活性鑒定,結(jié)果如圖3所示。根據(jù)先前的報道[16,23],非變性膠中觀察到的3條主帶,分別對應(yīng)線粒體(Mt)、胞質(zhì)(Cy)和葉綠體(Cp)中的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶同工酶。從圖3可以看出:在正常供氮情況下線粒體PtAspAT在根和莖中活性很高,但在幼葉和成熟葉中活性很低;相反,葉綠體PtAspAT在葉片(幼葉和成熟葉)中的活性很高,莖中的中等,而在根中的活性極低。胞質(zhì)PtAspAT具有與葉綠體PtAspAT同工酶類似的分布趨勢,但其活性條帶更弱。PtAspAT酶活性譜圖清楚地顯示,不同類型的PtAspAT同工酶表現(xiàn)出不同的特征酶譜模式,暗示它們在功能上有明顯的差異。
在0、2和10 mmol/L不同氮濃度處理后,可以發(fā)現(xiàn):在缺氮條件下,除成熟葉中3種PtAspAT同工酶酶活性無明顯變化外,在幼葉、莖段和根中酶活性都呈現(xiàn)出顯著的下降,這在幼葉的線粒體PtAspAT,莖和根的胞質(zhì)及葉綠體的PtAspAT同工酶中體現(xiàn)得尤為明顯;在高氮處理下,幼葉中線粒體PtAspAT酶活性顯著降低,胞質(zhì)和葉綠體PtAspAT活性略微下降,在成熟葉中各同工酶酶活性無明顯變化,在莖段和根中,3種PtAspAT同工酶酶活性,尤其是線粒體PtAspAT活性顯著上升。
表2 氮處理對毛果楊植物組培苗生長的影響
黑色框中為PtAspAT高度保守的氨基酸片段(1)~(9);“#”號代表原核型AspAT特有氨基酸
該進(jìn)化樹是利用MEGA7軟件采用ML方法構(gòu)建的,bootstrap測驗采用1 000次重復(fù),節(jié)點上的數(shù)字代表分枝的可信度。Cy:細(xì)胞質(zhì);Cp:葉綠體;Mt:線粒體
為進(jìn)一步探討PtAspAT在不同氮濃度條件下的變化規(guī)律,對PtAspATs各基因mRNA表達(dá)量進(jìn)行qPCR定量分析。從圖4可以看出:在缺氮條件下,除了在幼葉中的PtAspAT2,在成熟葉中的PtAspAT2、6和7以及在根系中的PtAspAT7&9表達(dá)量提高外,PtAspATs各基因在不同組織中的表達(dá)量總體上都呈現(xiàn)出下降的趨勢;在高氮脅迫下,相對于正常氮處理,PtAspAT4、5和6在各組織中表達(dá)量略微下降,PtAspAT1在成熟葉、PtAspAT3和10在幼葉中表達(dá)量都顯著提高。這些結(jié)果表明,低氮主要影響植物線粒體PtAspAT編碼基因(即PtAspAT2和7)的轉(zhuǎn)錄,而高氮則主要影響細(xì)胞質(zhì)PtAspAT編碼基因(即PtAspAT3 和 10)的轉(zhuǎn)錄。
YL:幼葉;ML:成熟葉;S:莖;R:根;Mt:線粒體;Cy:細(xì)胞質(zhì);Cp:葉綠體
YL:幼葉;ML:成熟葉;S:莖;R:根。*表示差異顯著性P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001
氮高效利用是植物細(xì)胞、組織、器官和產(chǎn)量建成的關(guān)鍵,然而由于氮高效利用屬于數(shù)量遺傳性狀,涉及的基因多且過程復(fù)雜(包括吸收、運(yùn)輸、同化和再轉(zhuǎn)移等一系列過程)[24]。目前氮高效利用的生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化天冬氨酸和谷氨酸相互轉(zhuǎn)化,為植物氮和碳代謝通路提供原料,是植物氮吸收利用過程中的重要代謝酶[13,18],因而有必要對其在氮代謝過程中的功能和分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。
qPCR結(jié)果(圖4)中,線粒體定位的PtAspAT2和7在低氮處理下表達(dá)量在根、莖、幼葉和老葉各組織總體都呈現(xiàn)出上升,但是線粒體PtAspAT同工酶酶活性在各組織(除老葉無明顯變化)反而都顯著下降(圖3);在莖段中,在高氮條件下葉綠體定位的PtAspAT5和9表達(dá)量降低(圖4),但是定位于葉綠體的PtAspAT同工酶酶活性卻增高(圖3)??梢奝tAspAT同工酶酶活性大小與其對應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄本的豐度高低變化趨勢并不總是相同的。前人[25]在玉米N同化相關(guān)的酶編碼基因研究中,也發(fā)現(xiàn)ZmAspAT的mRNA水平與酶活性變化趨勢存在不一致的現(xiàn)象。實驗結(jié)果與其相一致。這說明AspAT在植物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜,可能有轉(zhuǎn)錄或翻譯后機(jī)制參與。
在N脅迫條件下,毛果楊不同組織(根、莖、老葉和新葉)中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因表達(dá)和酶活性實驗結(jié)果表明,PtAspAT基因的mRNA表達(dá)量和酶活性大小與植物體氮濃度高低密切相關(guān),為揭示AspAT在植物生長和脅迫響應(yīng)中的代謝和生理意義奠定了理論基礎(chǔ)。