王洋　邱曉　孫海蓮　常虹　徐莉清

摘要 為了使德陽(yáng)柿能夠通過(guò)組織培養(yǎng)的方式在短期內(nèi)快速繁殖，探究德陽(yáng)柿培養(yǎng)基的最適培養(yǎng)條件。取一年生德陽(yáng)柿枝條上的休眠芽莖段無(wú)菌處理后作為外植體，選擇不同的基本培養(yǎng)基，對(duì)德陽(yáng)柿組培快繁技術(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，以MS 為基本培養(yǎng)基的德陽(yáng)柿休眠芽組培苗萌發(fā)率達(dá)81.13%，以MS（1/2N）為基本培養(yǎng)基的德陽(yáng)柿休眠芽萌發(fā)率為78.05%;德陽(yáng)柿誘導(dǎo)休眠芽以MS（1/2N）為基本培養(yǎng)基的長(zhǎng)勢(shì)要優(yōu)于以MS 為基本培養(yǎng)基。由此可知，MS（1/2N）培養(yǎng)基是德陽(yáng)柿幼芽初代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基。該研究提供了德陽(yáng)柿初代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，為其短期內(nèi)大量繁殖提供了技術(shù)指導(dǎo)和理論支持。

關(guān)鍵詞 德陽(yáng)柿;組培快繁;初代培養(yǎng);繼代培養(yǎng);無(wú)菌操作;接種;育苗

中圖分類號(hào) S665.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2020）22-0051-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.22.015

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation of Persimmon from Deyang， a New Species of Persimmon

WANG? Yang1，2，3，? QIU? Xiao1，2， SUN Hai-lian1，2? et al

（1.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences， Hohhot，Inner Mongolia 010031;2.Inner Mongolia Prataculture Research Center， Chinese Academy of Sciences，Hohhot，Inner Mongolia 010031;3.Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070）

Abstract In order to make Deyang persimmon multiply rapidly in a short time by tissue culture， the optimum culture conditions of Deyang persimmon were studied. The stem segment of dormant buds on the branches of deyang persimmon was treated asepsis and used as explants. The germination rate of the dormant buds in Deyang persimmon using MS as the basic medium was 81.13%， while the germination rate of the dormant buds in Deyang persimmon using MS（1/2 n） as the basic medium was 78.05%. The growth rate of the dormant buds in Deyang persimmon with MS（1/2 n） as the basic medium was better than that with MS as the basic medium. Finally， it can be concluded that MS（1/2 n） medium was the optimal medium for the primary bud culture of deyang persimmon. This study provided the optimum medium for the primary culture of Deyang persimmon and provided technical guidance and theoretical support for its short-term mass reproduction.

Key words Deyang persimmon;Tissue culture and rapid propagation;Primary culture;Subculture;Aseptic operation;Vaccination;Seedling

作者簡(jiǎn)介 王洋（1996—），女，內(nèi)蒙古呼和浩特人，研究實(shí)習(xí)員，從事草業(yè)科學(xué)研究。*通信作者，高級(jí)工程師，從事種質(zhì)資源研究。

收稿日期 2020-03-24

德陽(yáng)柿（Diospyros sp.Deyangshi;2n=4x=60），又稱紅花野毛柿，為雌雄異株的落葉果樹，主要產(chǎn)自四川省德陽(yáng)市，是2007年國(guó)家柿種質(zhì)資源圃從四川德陽(yáng)采集的野生資源。且利用德陽(yáng)柿的種子播種后長(zhǎng)出的實(shí)生苗，第二年就能開花[1]。因其具有早花等特性，成為學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題[2]。

張永芳[3]利用掃描電鏡對(duì)其進(jìn)行孢粉學(xué)觀察和SRAP分子標(biāo)記分析，將其確定為柿屬的一個(gè)新品種，并證實(shí)為四倍體基因型。發(fā)現(xiàn)該品種柿屬植物的早花特性在研究果樹植物遺傳轉(zhuǎn)化方面具有巨大的應(yīng)用潛力。但開展植物基因工程技術(shù)是德陽(yáng)柿得以更廣泛應(yīng)用的前提，其關(guān)鍵應(yīng)用前提是建立德陽(yáng)柿較好的再生體系[4]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的前提是建立高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)。

關(guān)于柿的初代組織培養(yǎng)技術(shù)，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)方面的研究[5]。研究發(fā)現(xiàn)甜柿上西早生葉片適合在低礦物質(zhì)元素，尤其是較低氮素含量的培養(yǎng)基中增殖與生長(zhǎng)[6]。君遷子休眠芽初代培養(yǎng)中，DKW培養(yǎng)基最適合其生長(zhǎng)發(fā)育[7]。以磨盤柿4月中旬生長(zhǎng)中的幼芽和8月下旬休眠芽為外植體研究發(fā)現(xiàn)，高濃度ZT不利于柿的初代培養(yǎng)[8]。研究發(fā)現(xiàn)基本培養(yǎng)基DKW對(duì)磨盤柿的繼代增殖效果最好[9]，且在ZT（1.0～2.0 mg/L）和IAA（0.1 mg/L）的激素配比條件下，磨盤柿繼代苗的分化和長(zhǎng)勢(shì)最好[10]。研究表明柿組培苗根尖的有無(wú)與不定芽的再生效果無(wú)關(guān)，而根段長(zhǎng)度與不定芽再生效率呈極顯著正相關(guān)[11]。

德陽(yáng)柿是一個(gè)四倍體柿屬新種[12]，具有早花特性，是柿基因工程研究的理想材料[13]。但目前國(guó)內(nèi)外尚未見關(guān)于德陽(yáng)柿高效、穩(wěn)定的植株再生體系的研究，在一定程度上限制了對(duì)德陽(yáng)柿使用基因工程技術(shù)研究[14]。因柿組織培養(yǎng)方法品種間差異較大，且含酚類物質(zhì)較多，建立完整的組培快繁體系較困難[15]，不同品種之間最適培養(yǎng)基的成分配比不完全相同，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理將參照現(xiàn)有的柿屬植物組織培養(yǎng)研究成果，進(jìn)一步探究德陽(yáng)柿這一特定品種的培養(yǎng)基成分最佳配比。筆者以德陽(yáng)柿休眠芽為外植體，比較組培過(guò)程中的各種因素，篩選出最適的生長(zhǎng)發(fā)育與再生培養(yǎng)條件，建立德陽(yáng)柿組織培養(yǎng)體系，為后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化研究提供試驗(yàn)材料，為德陽(yáng)柿基因轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為德陽(yáng)柿（Diospyros sp.Deyangshi），為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柿基因庫(kù)2015年長(zhǎng)勢(shì)良好的成年樹。

1.2 3種不同培養(yǎng)基的篩選

1.2.1 外植體接種前處理。

取一年生德陽(yáng)柿枝條上的休眠芽，剝?nèi)パ客鈧?cè)的2～3個(gè)鱗片，用清水淋洗45 min，去除表面灰塵和細(xì)菌，再將生長(zhǎng)狀況良好的芽用刀片切下，用75%乙醇表面消毒30 s，再用2%的次氯酸鈉浸泡消毒4 min，在浸泡過(guò)程中要不斷搖動(dòng)，最后用無(wú)菌水沖洗5次，每次5 min。

1.2.2 不同基本培養(yǎng)基配制?；九囵B(yǎng)基有3種：MS（1/2N）培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、DKW培養(yǎng)基。所有的基本培養(yǎng)基中均含有蔗糖30.0 mg/L，瓊脂6.0 mg/L，PVP-K40 0.6 mg/L，ZT 0.5 mg/L，IAA 0.01 mg/L，pH為5.8?；九囵B(yǎng)基配制好后，于121 ℃高溫滅菌15 min，然后置于超凈工作臺(tái)中冷卻至55 ℃左右，搖勻后分裝至培養(yǎng)瓶中。

1.2.3 接種。

將休眠芽用75%乙醇進(jìn)行表面滅菌30 s，再用2%的NaClO浸泡10～15 min。將清洗后的休眠芽剝?nèi)ネ怊[片，留莖尖約1.5 mm，保留2～3片葉原，接種到相應(yīng)的初代培養(yǎng)基上，每個(gè)組合接種20個(gè)，重復(fù)3次，置于25 ℃、3 000 lx光強(qiáng)、16 h/d光照的人工培養(yǎng)室培養(yǎng)。

1.3 初代培養(yǎng)最適氮含量的探究

根據(jù)上述試驗(yàn)可得，MS培養(yǎng)基和（1/2N）MS培養(yǎng)基對(duì)于德陽(yáng)柿休眠芽的初代培養(yǎng)較為適宜，且成活率相差不大，但氮元素的含量對(duì)于植株的形態(tài)構(gòu)成有一定的影響。氮元素是構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要成分，通過(guò)影響基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)改變植株的形態(tài)，氮元素缺乏時(shí)，植株矮小，葉片黃化，成熟后果實(shí)品質(zhì)差，坐果率低，嚴(yán)重影響果實(shí)的產(chǎn)量，而氮元素過(guò)多時(shí)，植株徒長(zhǎng)，抗逆性差，后期果實(shí)含糖量較低，發(fā)育緩慢。因此，植株培育初期要嚴(yán)格控制培養(yǎng)基中的氮元素含量，并以此為依據(jù)進(jìn)行德陽(yáng)柿休眠芽初代培養(yǎng)最適氮含量的探究（表1）。根據(jù)前述試驗(yàn)可得，最適氮元素含量在MS培養(yǎng)基氮元素含量與（1/2N）MS培養(yǎng)基氮元素含量之間。

根據(jù)MS培養(yǎng)基配方可以看出，MS培養(yǎng)基與（1/2N）MS培養(yǎng)基中氮元素的差別在于（1/2N）MS培養(yǎng)基中KNO3和NH4NO3的成分是否減半，因此，將通過(guò)設(shè)計(jì)KNO3和NH4NO3的濃度梯度來(lái)探究德陽(yáng)柿休眠芽初代培養(yǎng)基中最適氮元素的含量（表2）。

1.4 葉片愈傷組織培養(yǎng)最適激素含量的探究

1.4.1 外植體接種前處理。

采摘德陽(yáng)柿當(dāng)年新梢，留頂端3～4片葉片，取下面所有葉片，用流水沖洗 30～60 min，然后放入已經(jīng)滅菌好的錐形瓶中，用75%乙醇進(jìn)行表面滅菌30 s，再用2%NaClO浸泡3～4 min，浸泡過(guò)程要不斷搖動(dòng)，最后用無(wú)菌水沖洗4～5次。在無(wú)菌條件下，留頂端3～4片葉片，取下面所有葉片，將葉片橫切成4 mm×4 mm大小，接種到配制好的10種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基以 MS（1/2N）為基本培養(yǎng)基，添加的激素濃度按表3設(shè)計(jì)。每個(gè)處理接種50片，先暗處

理20 d，統(tǒng)計(jì)葉片愈傷組織形成率（利用倫理數(shù)值），將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種到MS（1/2N）+PVP 0.6 mg/L+ZT 1 mg/L+IAA 0.1 mg/L 培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)至正常光照下培養(yǎng)。30 d后分別統(tǒng)計(jì)分化率、平均不定芽數(shù)。

葉片接種培養(yǎng)基：MS（1/2N）+PVP 0.6 mg/L+IAA 0.1 mg/L +蔗糖 20 g/L+ 瓊脂 7.5 g/L，pH=5.8。

1.4.2 不同激素含量的配制。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表3，柿屬植物葉片愈傷組織誘導(dǎo)的最適TDZ濃度為0.01～0.10 mg/L，最適NAA濃度為0～0.2 mg/L[7]，因此，以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)柿屬植物資源庫(kù)樹齡2年的德陽(yáng)柿春季葉片為外植體，以（1/2N）MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每組激素組合接種葉片切塊50片，探究德陽(yáng)柿葉片愈傷組織培養(yǎng)的最適TDZ和NAA濃度。外植體葉片在培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后開始生長(zhǎng)，20 d后出現(xiàn)嫩綠色的愈傷組織。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種不同培養(yǎng)基的篩選

德陽(yáng)柿休眠芽的無(wú)菌莖段接入初代培養(yǎng)基15 d后開始萌發(fā)，30 d左右，休眠芽發(fā)育為2～3 cm（30 d為一個(gè)觀察周期）。

MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率為8113%，長(zhǎng)勢(shì)狀況一般，休眠芽在培養(yǎng)基中萌發(fā)速度較快，葉片較MS（1/2N）培養(yǎng)基黃化嚴(yán)重、稀疏，葉片偏黃且卷曲嚴(yán)重，植株細(xì)弱;MS（1/2N）培養(yǎng)基的萌發(fā)率為78.05%，長(zhǎng)勢(shì)狀況良好，休眠芽在培養(yǎng)基中萌發(fā)快，葉展開幅度大，且濃綠茂盛（圖1），由此可知，在休眠芽生長(zhǎng)過(guò)程中，氮含量顯著影響葉片和植株的發(fā)育狀況和萌發(fā)率;DKW培養(yǎng)基的萌發(fā)率為52.94%，長(zhǎng)勢(shì)狀況一般，休眠芽15 d時(shí)葉片和莖段發(fā)育較為緩慢，株高在0.5～1.0 cm，葉片較少且卷曲嚴(yán)重，莖桿細(xì)弱，植株多為芽體變大，未展葉（表4）。

該研究采用高溫滅菌法處理德陽(yáng)柿休眠芽和葉片，從而獲得大量試驗(yàn)所需的無(wú)菌外植體，為組織培養(yǎng)的研究提供良好材料[23]。同時(shí)開展德陽(yáng)柿休眠芽組培快繁技術(shù)研究，為德陽(yáng)柿組培快繁初代培養(yǎng)尋找合適的基本培養(yǎng)基配比和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑用量，提高了德陽(yáng)柿初代培養(yǎng)過(guò)程中的植株成活率，改善了植株的生長(zhǎng)狀況，為德陽(yáng)柿的大規(guī)模批量生產(chǎn)和工廠化育苗提供了技術(shù)支撐。

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