馬紅梅 唐超英 皮子瑤 張漢花

摘 要：為優(yōu)化乳酸菌固定成球的條件，研究以海藻酸鈉為載體，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、菌液添加量、滴球速度等對(duì)乳酸菌固定成球的影響，并以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液釋放固定化小球，考察處理時(shí)間與pH值對(duì)乳酸菌固定化小球釋放效果的影響。結(jié)果表明：當(dāng)海藻酸鈉濃度為2.0%、CaCl2濃度為2.5%、菌液添加量為20 mL（菌液添加量與無菌水比值為1∶1）時(shí)，乳酸菌固定化小球成球性能最佳;pH值為6.0～6.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液可在30 min內(nèi)完全釋放固定化小球。研究還測(cè)定了德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和屎腸球菌（Enterococcus Faecium）3種乳酸菌固定化前后菌體的活性，發(fā)現(xiàn)德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌的活性在固定化前后差異不顯著，但屎腸球菌的活性在固定化前后的差異較大。

關(guān)鍵詞：乳酸菌;固定化;釋放;活性

中圖分類號(hào)：Q937文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2020）10-0050-03

Abstract： In order to optimize the conditions for solidifying lactic acid bacteria into pellets， this study used sodium alginate as a carrier to investigate the effects of sodium alginate concentration， CaCl2 concentration， the amount of bacteria solution and dropping speed on the solidification of lactic acid bacteria into pellets by single factor test and orthogonal test. Furthermore， the solidified lactic acid bacteria pellets were dissolved in citric acid-sodium citrate buffer solution to detect the effects of treatment time and pH value on the activity release of lactic acid bacteria. The results showed the pellet-forming performance of lactic acid bacteria was the best when the concentration of sodium alginate was 2.0%， the concentration of CaCl2 was 2.5%， and the addition of bacterial solution was 20 mL （the ratio of bacterial solution to aseptic water was 1∶1）. Citric acid-sodium citrate buffer （ pH 6.0 ～ 6.5） can completely dissolve lactic acid bacteria pellets within 30min. The activities of Lactobacillus delbrueckii， Streptococcus thermophilus and Enterococcus faecium were detected before and after solidification. It was found that the activities of Lactobacillus delbrueckii and Streptococcus thermophilus had no significant difference before and after solidification， but the activity of Enterococcus faecium varied obviously before and after solidification.

Key words： lactic acid bacteria; solidification; release; activity

微生物的固定化是指將微生物固定在不溶性的載體上，它不僅可提高單位體積內(nèi)微生物的生產(chǎn)效率和生產(chǎn)能力，還能延長微生物的生長周期，便于微生物的回收和利用[1]。在固定微生物的過程中，需要選擇合適的載體。最常用的載體為包埋載體，它有2種類型，一種是無機(jī)載體，另一種是有機(jī)載體，前者包括活性炭等，后者包括海藻酸鈉、聚乙烯醇等。 由于瓊脂和殼聚糖凝膠的硬度差，聚乙烯醇和聚丙烯酰胺凝膠有毒，而海藻酸鈉凝膠具良好的綜合性能，不會(huì)毒害生物細(xì)胞，且易降解，更適用于微生物細(xì)胞的固定[2-3]。有關(guān)乳酸菌固定化的應(yīng)用報(bào)導(dǎo)較多，但對(duì)固定與釋放條件對(duì)微生物生長的影響的報(bào)導(dǎo)并不多見。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、屎腸球菌（Enterococcus Faecium），均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;主要試劑有海藻酸鈉為食用級(jí)，氯化鈣、檸檬酸、檸檬酸三鈉等為分析純;培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同因素對(duì)固定化乳酸菌成球的影響 （1）海藻酸鈉濃度對(duì)乳酸菌固定化的影響。將海藻酸鈉分別配成4.0%、3.0%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%的膠體液。用9號(hào)針管吸取上述膠體液，以一定速度滴入濃度為1.5%氯化鈣溶液中固化20～30 min。（2）CaCl2濃度對(duì)乳酸菌固定化的影響。將CaCl2配成濃度為0.5%、2.5%、1.5%的溶液。將濃度為2.5%含菌海藻酸鈉溶液以一定的速度分別滴入不同濃度的CaCl2溶液中固化20～30 min。（3）菌液添加量。將3種乳酸菌活化長滿斜面后制成5、10、20、30 mL菌懸液，分別加入海藻酸鈉膠體液中攪拌均勻。用針管吸取膠體液，以一定的速度滴入濃度為1.5% CaCl2溶液中固化20～30 min。（4）滴球速度。在海藻酸鈉濃度為2.5%及菌液添加量為20 mL的條件下，以秒表計(jì)時(shí)，以不同的速度將混合液滴入1.5% CaCl2溶液中固化20～30 min。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在1.2.1的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)固定化乳酸菌小球成球影響因素較大的3個(gè)因素即海藻酸鈉濃度（A）、CaCl2濃度（B）、菌液添加量（C）進(jìn)行L9（3）4正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)如表1，固定化小球成球性能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考賀銀鳳等[4]的研究。

1.2.3 固定化乳酸菌球的釋放 取濃度分別為0.1 mol/L的檸檬酸溶液及檸檬酸鈉溶液，按表2配成 pH值分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。每支試管中加入5 g干燥的固定化乳酸菌小球，震蕩30 min，記錄各試管中固定化小球的釋放情況。

1.2.4 固定化乳酸菌的活菌計(jì)數(shù) 將德氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌、屎腸球菌菌原液以及固定化的3種乳酸菌小球分別稀釋至10-6、10-7和10-8后，在LB培養(yǎng)基中涂布于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h計(jì)數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用Minitab 17（中文版）對(duì)正交設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析;采用SPSS 19.0軟件對(duì)兩配對(duì)樣本進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)固定化乳酸菌成球的影響

2.1.1 海藻酸鈉濃度 不同濃度的海藻酸鈉對(duì)固定化乳酸菌小球的影響見表3。由表3可知，海藻酸鈉濃度會(huì)影響小球的成型。當(dāng)濃度低于1.5%時(shí)，由于海藻酸鈉膠體液濃度過稀，擠球時(shí)容易連成線，難成球;當(dāng)濃度在1.5%～2.5%時(shí)，海藻酸鈉膠體液濃度適中，擠球容易，且成規(guī)則球形;當(dāng)濃度在3.0%時(shí)，海藻酸鈉膠體液濃度過稠，成球不規(guī)則，帶尾巴;當(dāng)濃度在4.0%以上時(shí)，海藻酸鈉膠體液濃度過稠，容易堵塞針口，擠球困難，帶尾巴。

2.1.2 CaCl2濃度 不同濃度的CaCl2對(duì)固定化乳酸菌成球的影響見表4。CaCl2濃度決定著凝膠球的硬度。由表4可知，當(dāng)濃度在1.5%以下，凝膠球硬度一般;當(dāng)濃度大于1.5%時(shí)，小球的硬度良好。研究表明，濃度越低，固定化凝膠球的性能越差，濃度越高，微生物細(xì)胞的活性越差。

2.1.3 菌種添加量 不同菌液添加量對(duì)固定化乳酸菌成球的影響見表5。由表5可知，菌液的量對(duì)成球的影響不大。添加的細(xì)菌數(shù)量直接影響固定化乳酸菌凝膠球的細(xì)菌含量。當(dāng)菌液添加量少于10 mL時(shí)，固定化乳酸菌凝膠球的含菌量相對(duì)較少，在實(shí)際應(yīng)用過程中會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。因此，在實(shí)際應(yīng)用過程中，當(dāng)海藻酸鈉濃度為2.5%時(shí)，菌液添加量與無菌水的比值在1/3～1都是比較合適的。

2.1.4 滴球速度 在2.5%的海藻酸鈉、1.5%的CaCl2、菌液添加量20 mL（菌液添加量與無菌水比值為1∶1）的情況下，不同滴球速度對(duì)固定化乳酸菌成球的影響見表6。由表6可以看出，滴球速度影響小球的成型及大小。速度小于等于80個(gè)/min時(shí)，均易成球，且大小適中。當(dāng)?shù)味ㄋ俣却笥?06個(gè)/min時(shí)，雖易成球，但球形大小不一，當(dāng)速度為148個(gè)/min時(shí)，不能形成小球，易成線性，且線性大小不規(guī)則。相關(guān)研究表明，固定化乳酸菌球的大小對(duì)包埋的量有影響，成球越大，固定的量越少，但總體差異不大。因此在實(shí)際操作過程中，只要不連成線，滴球速度可以盡量快。

2.2 正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)及方差分析

各因素對(duì)固定化乳酸菌成球影響的結(jié)果見表7，各因素對(duì)固定化小球的固化影響的差異性見表8。由表7可知，3個(gè)因素的極差值均大于空列的極差值，說明3個(gè)因素有顯著影響效果。其中A>B>C，即海藻酸鈉濃度對(duì)成球的影響最大，其次是CaCl2濃度，菌液添加量的影響最小。表8方差分析結(jié)果表明， A和B的P值均小于0.05，說明海藻酸鈉的濃度與CaCl2濃度對(duì)固定化小球成球的影響有顯著差異;C值的P值大于0.05，表明菌液量對(duì)固定化小球的成球影響不顯著，此與表7的結(jié)果一致。綜合分析得出，固定化乳酸菌小球的最優(yōu)成球條件組合為A2B2C2，即海藻酸鈉濃度為2.0%、CaCl2濃度為2.5%、菌液添加量為20 mL（菌液添加量與無菌水比值為1∶1）。

2.3 固定化乳酸菌小球的釋放試驗(yàn)結(jié)果

由表9可知，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液釋放固定化乳酸菌小球時(shí)，時(shí)間和緩沖液的pH值均會(huì)影響小球釋放程度，當(dāng)處理時(shí)間小于20 min時(shí)或pH值小于6.0時(shí)，固定化小球均不會(huì)釋放，pH值越大，固定化小球越容易釋放;當(dāng)pH值≥6.0時(shí)，固定化小球在30 min內(nèi)完全釋放。

2.4 固定化對(duì)乳酸菌活性的影響

固定化對(duì)3種乳酸菌活性的影響如表10。由表10可知，德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌在固定化前后的活性變化不明顯，而屎腸球菌的活性在固定化前后變化顯著。德氏乳桿菌固定化后活性依然很高，活菌數(shù)高達(dá)94.4%;嗜熱鏈球菌次之，為81.0%;固定化對(duì)屎腸球菌的活性影響最大，固定化處理后活菌率為70.0%，由此可見，固定化對(duì)不同種類乳酸菌的活性影響不一樣。

3 結(jié) 論

乳酸菌固定化小球成球性能最佳條件與張強(qiáng)等[5]、汪洋等[6]研究固定化小球的條件基本一致;使固定化乳酸菌小球迅速釋放的條件為pH值6.0～6.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，此法對(duì)不同乳酸菌固定化前后的活性影響不一樣，其中對(duì)屎腸球菌的影響較大，其原因可能是固定化方法或固定化載體影響了菌體生長[7]，也可能是屎腸球菌的釋放pH值與生長pH值不一致導(dǎo)致的。

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（責(zé)任編輯：張煥裕）